Informasjon

Gap junction omsetning

Gap junction omsetning



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Gapforbindelsesproteiner, connexins, er kjent for å danne intercellulære hemichannels, mellom to tilstøtende celler. Disse veikryssene opprettholdes celleadhesjonsproteiner (kadheriner), men omsetningen av konnexiner er ganske rask. Når disse konnexinene blir snudd, danner erstatningskonnexinene kanalen på nytt på samme sted som tidligere eksisterende kanaler, eller er mønsteret stokastisk? Sagt på en annen måte, hvis vi vet at celler i kulturen har dannet gapekryss, og for en celle, har den forskjellige tilkoblede naboer med tiden?


Dette er et interessant spørsmål. Når man leser disse to artiklene som er lenket nedenfor, ser det veldig ut til at konneksinene er snudd og degradert med at kanalen mer eller mindre bor på samme sted (figuren er hentet fra den første artikkelen, men den andre har en lignende):

Etter dette blir konnexinene syntetisert og deretter utsatt for ER og deretter Golgi for riktig proteinmodning og oligomerisering til hemikanaler (feilfoldede proteiner utsettes for proteasomal nedbrytning). De blir deretter eksportert fra trans-Golgi i små vesikler til cellemembranen, transportert til sarcolemma hvor de danner komplette gapforbindelseskanaler med hemichannels fra en annen celle. Enkeltkanaler aggregeres i gapforbindelsesplater.

Konnexinene nedbrytes i proteasomet og lysosomet. Det diskuteres at post-translasjonelle modifikasjoner som fosforylering og ubiquitination spiller en viktig rolle her.

Nedbrytningen ser ut til å skje ved de dannede kanalene. Dette ble testet på to måter: Når eksporten av nye proteiner til membranen blir hemmet, går konnexinene i membranen og kryssene tapt over tid. Hvis proteasomet blir hemmet, vokser tallet. Og når begge veier er hemmet (eksport og nedbrytning) er tallet omtrent konstant. Se papir 3 for mer informasjon. Dette viser at prosessen med å danne veikryssene og nedbryte konneksinene er permanent og at celler som danner kryss med hverandre blir på samme sted.

Referanser:

  1. Connexin -uttrykk og omsetning
  2. Veier for nedbrytning av konneksiner og gapekryss
  3. Nedbrytning av connexin43 gap junctions involverer både proteasomet og lysosomet.

Gap Junction Omsetning oppnås ved internalisering av små endocytiske dobbeltmembranvesikler

Dobbel-membran-spennende gap junction (GJ) kanaler klynger seg inn i todimensjonale matriser, betegnet plakk, for å gi direkte celle-til-celle kommunikasjon. GJ-plakk inneholder ofte sirkulære, kanalfrie domener (omtrent 0,05-0,5 mamma i diameter) identifisert for 30 år siden og betegnet ikke-funksjonelle membran (NM) domener. Vi viser, ved å uttrykke GJ -proteinet connexin43 (Cx43) merket med grønt fluorescerende protein, eller det nye fotokonverterbare fluorescerende proteinet Dendra2, at NM -domener ser ut til å være rester generert av internalisering av små GJ -kanalhoper som knopper over tid fra sentrale plakkområder . Kanalklynger internaliserte i løpet av sekunder og dannet endocytiske dobbeltmembrane GJ-vesikler (ca. 0,18-0,27 mamma i diameter) som ble degradert av lysosomale veier. Overraskende nok ble NM -domener ikke gjenbefolket av omkringliggende kanaler og forble i stedet mobile, smeltet med hverandre og ble utvist ved plakettkanter. Kvantifisering av internaliserte, fotokonverterte Cx43-Dendra2-vesikler indikerte en GJ-halveringstid på 2,6 timer som faller innenfor den estimerte halveringstiden på 1-5 timer rapportert for GJ-er. Sammen med tidligere publikasjoner som avslørte kontinuerlig opphopning av nysyntetiserte kanaler langs plakkanter og samtidig fjerning av kanaler fra plakkesentre, antyder dataene våre hvordan den kjente dynamiske kanalpåfyllingen av funksjonelle GJ -plakk kan oppnås. Våre observasjoner kan ha implikasjoner for prosessen med endocytisk vesikelblomstring generelt.


Omsetnings- og fosforyleringsdynamikk for connexin43 gap junction protein i dyrkede hjertemyocytter

Dyrkede kardiomyocytter ble brukt til å studere omsetning og posttranslasjonell modifikasjon av connexin43 (Cx43), et stort gap-junction-protein i neonatale hjertemyocytter. Immunutfelling av [35S] Met-merkede lysater med anti-Cx43 antistoffer etterfulgt av analyse ved bruk av SDS/PAGE og fluorografi avslørte to bånd, ett ved 40 kDa og det andre ved 42 kDa. Alkalisk fosfatase-behandling av [35S] Met-merket Cx43 eliminerte båndet ved 42 kDa, noe som tyder på at det representerte en fosforylerte form av proteinet. Dette ble bekreftet av [32P] P1 -inkorporering i 42 kDa -båndet, men ikke i båndet ved 40 kDa. I tillegg ble en annen alkalisk fosfatasefølsom fosforylert form av Cx43 identifisert ved 44 kDa. I pulsjaktforsøk ble halveringstiden til Cx43 i kardiomyocytter bestemt til å være 1-2 timer. Videre ble det funnet at omsetningshastigheten for fosfatgrupper på Cx43 var eksperimentelt definert av halveringstiden til proteinet. Observasjonen om at fosfatgrupper kan forbli med proteinet gjennom hele livet, er i samsvar med funnet at Cx43 hovedsakelig fosforyleres i isolerte plakater for hjerteklopp for voksne rotter. Vi postulerer at den raske omsetningen av Cx43 og dens flere fosforyleringssteder spiller viktige roller i reguleringen av celle-cellekommunikasjon via gapekryss.


Transport av Connexins og Gap Junction Omsetning i levende celler visualisert ved hjelp av grønt fluorescerende protein merket Connexins.

Connexins oligomeriseres til hemikanaler, trafikk til celleoverflaten og legger til med hemichannels fra en tilstøtende celle for å danne intercellulære gapforbindelseskanaler. Pulsechase-studier har avslørt at konnexiner har en kort halveringstid fra 1-5 timer. For å undersøke mekanismene som er involvert i connexinhandel, gap junction -montering og internalisering i levende celler, smeltet vi grønt fluorescerende protein (GFP) til amino- eller karboksylterminalen til full lengde -connexins (Cx). Når cDNA-koding av Cx43-GFP ble transfektert i kommunikasjonskompetente NRK-celler, Cx43-negative MDCK-celler eller kommunikasjonsmangel Neuro2A- eller HeLa-celler, ble fusjonsproteinet av forutsagt lengde uttrykt, transportert og satt sammen i funksjonelle gap-kryss (figur 1 ). Spesielt hemmet sammensmeltningen av GFP til aminoterminalen til Cx43 (GFP-Cx43) eller Cx32 (GFP-Cx32) ikke co-translasjonell innsetting av disse polytopiske type IV-konnexinene i membranen og som et resultat av gapforbindelsesplater montert ved cellecell -grensesnitt.


Gap junction-omsetning, intracellulær handel og fosforylering av connexin43 i brefeldin A-behandlede rotte brysttumorceller

Intercellulære gapforbindelseskanaler antas å dannes når oligomerer av konneksiner fra en celle (konnexoner) registrerer og parrer seg med konneksoner fra en nabocelle underveis for å danne tett pakket matriser (plakk). I den nåværende studien brukte vi rottebrystet BICR-M1Rk tumorcellelinje for å undersøke menneskehandel, modning og kinetikk til connexin43 (Cx43). Cx43 ble definitivt vist å være i Golgi-apparatet i tillegg til steder for cellecelleoppsett i disse cellene og i normale rottenyreceller. Brefeldin A (BFA) blokkerte Cx43-handel mot overflaten av brystcellene og forhindret også fosforylering av 42-kD-formen av Cx43 til 44- og 46-kD-arter. Fosforylering av Cx43 skjedde imidlertid i nærvær av BFA mens den fremdeles var bosatt i ER- eller Golgi-apparatet og ga en 43 kD form av Cx43. Videre var 42- og 43-kD-former for Cx43 fanget i ER/Golgi-rommet tilgjengelig for gap junction-montering ved fjerning av BFA. Mammarceller behandlet med BFA i 6 timer mistet allerede eksisterende gapforbindelse "plakk", samt 44- og 46-kD-former for Cx43 og funksjonell kobling. Disse hendelsene var reversible 1 time etter fjerning av BFA og var ikke avhengig av proteinsyntese. Oppsummert gir vi sterke bevis på at i BICR-M1Rk-tumorceller: (a) Cx43 fosforyleres midlertidig i ER/Golgi-apparatet, (b) Cx43 fanget i ER/Golgi-rommet er ikke utsatt for rask nedbrytning og er tilgjengelig for montering av nye gapforbindelseskanaler ved fjerning av BFA, (c) den raske omsetningen av gapforbindelsesplater er korrelert med tapet av 44- og 46-kD-former for Cx43.


Konklusjoner og perspektiver

Siden data som dokumenterer funksjonene til konnexiner i munnhelsen og munnsykdommen fremdeles er begrenset, er informasjonen hovedsakelig begrenset til fordelingen av Cx i forskjellige orale vev i forskjellige utviklingsfaser. Langt færre rapporter har beskrevet rollen til funksjonelle GJ -er ved orale sykdommer som periodontitt og kronisk apikal periodontitt. Tidligere studier har gitt støtte for ytterligere roller for Cx i oral utvikling og patogenesen og prognosen for orale sykdommer. Studier av forskjellige Cx i orale vev er kategorisert i tabell 1. Samlet spiller Cxs og GJs viktige roller for å opprettholde normal utvikling og funksjon av orale vev. Spesifikke Cx kan potensielt representere molekylære mål for behandling av visse munnsykdommer. Derfor ser Cxs og gap junctions ut til å være et veldig interessant felt for ytterligere forskning.


Gap Junction Proteiner

Gapforbindelseskanaler er unike. Ingen annen kanal hos virveldyr gir en lukket kanal for direkte diffusjonsutveksling av ioner og små molekyler mellom celler, og få andre membrankanaler har pordiametre som er store nok til å imøtekomme metabolitter og signalmolekyler med molekylvekter så høyt som 1000 Da. Videre, slik det er omtalt i to artikler i dette nummeret av Sirkulasjonsforskning, gapekryss dannes av proteiner med uvanlig rask omsetningstid 1 og ekstremt fleksible uttrykksmønstre. 2

Konnexinproteinene som danner gapforbindelseskanaler er kodet av en genfamilie med minst 14 medlemmer i gnagere. Hvert konnexinprotein har fire transmembrane domener, en intracellulær og to ekstracellulære sløyfer, og cytoplasmisk lokaliserte karboksyl- og aminoterminier. Seks konneksinmolekyler, mest sannsynlig ordnet slik at deres tredje transmembrane domener strekker seg gjennom kanalens lumen, omfatter hemichannels eller konneksoner som er bidratt med hver celle i det koblede paret. Komplette gapforbindelseskanaler, med tilkoblinger som er forankret over gapet i ekstracellulært rom ved interaksjoner mellom de ekstracellulære løkkene, blir vanligvis samlet sammen og danner øyer av partikler eller groper i frysefrakturerte preparater, lineært anbragte, men litt adskilte membraner i tynnsnittet elektron mikroskopiske og makulære områder av intercellulær immunfarging med gap junction -antistoffer.

Det er bemerkelsesverdig at i studier som først ble utført på rotterlever in vivo 344 og deretter i hjertemyocytter og hepatocytter og cellelinjer i kultur, har 5 6 7 8 omsetningstidene for konnexinmolekyler blitt vist å være svært korte. Artikkelen av Beardslee et al 1 gir direkte bevis for rask omsetningsdynamikk av connexin43 (Cx43) i hjertevev, ved bruk av [35 S] metionin tilsatt til Langendorff-perfusjonerte rottehjerter. I disse forsøkene var det målte forfallet av radioaktivitet i immunutfelt Cx43 monoexponential, som passet best med en halveringstid på bare 1,3 timer. Dette funnet er betydelig på flere måter. For det første strekker den seg in vitro-observasjoner på dyrkede myocytter og cellelinjer, der intracellulær distribusjon og behandling av konnexiner kanskje ikke er nøyaktig det samme som in vivo, til hjertevev og viser at målinger av halveringstid på Cx43 fra begge preparatene er like. For det andre innebærer det monoexponensielle forfallet av inkorporert radioaktivitet i immunutfelt Cx43 fravær av en betydelig mengde proteiner med lengre levetid. Til slutt indikerer dette funnet at ved hvert grensesnitt mellom myocytter i hjertet blir proteinene som danner gapforbindelseskanaler fullstendig utvekslet flere ganger hver dag.

Den raske omsetningen av gap -junction -proteiner øker den fristende muligheten for at ombygging av kommunikasjonsrom kan skje over en kort periode, og understreker også viktigheten av å forstå de intracellulære menneskehandelhendelsene som oppstår i løpet av denne tidsrammen. Hva er membranfoldingen og proteinmodifikasjonene som oppstår i løpet av den korte levetiden til et konnexinmolekyl, og hvor mye av levetiden blir brukt under transport sammenlignet med tiden som fungerer som en intercellulær kanal? Nylige arbeider fra flere laboratorier har begynt å løse disse problemene, og selv om presise oppholdstider for konnexiner i hvert av de subcellulære avdelingene fremdeles ikke er godt etablert, blir de generelle trekkene ved connexin -handelsveiene og posttranslasjonal behandling tydeligere.

Connexin32 (Cx32) og Cx43 ser ut til å være insamlet cotranslasjonalt i endoplasmatisk retikulum (ER) membran, mens det er bevis for at konnexin 26 (Cx26) innsetting kan være cotranslasjonell eller posttranslasjonell. 6 8 9 10 Fettsyreacylering av Cx32 og Cx26 har blitt rapportert å være en tidlig posttranslasjonell behandlingshendelse som ser ut til å skje nær tidspunktet for proteinbretting i membranen 9 om Cx43 gjennomgår lignende modifikasjoner gjenstår å bestemme. Nyere studier på Cx43 og Cx32 10 11 ved bruk av in vitro -oversettelse i bukspyttkjertelmikrosomer indikerer at den første membranfoldingshendelsen er ganske skjør, med en tendens til proteolytisk spaltning av det første membranoverspennende domenet (TM1). Om proteinchaperoner eller cotranslasjonale proteinmodifikasjoner stabiliserer begravelsen av TM1 i plasmamembranen i hele celler, gjenstår også å bestemme.

Nysyntetiserte konneksiner forblir tilsynelatende som uavhengige monomerer når de begynner sin reise langs sekretorisk transportrute fra ER til Golgi -apparatet. Akkurat hvor det er at connexinene kobles sammen til connexons er uklart, selv om nyere bevis favoriserer et mer proksimalt sted, nær ER-Golgi-overgangen 9 10 i stedet for det distale trans-Golgi -regionen som opprinnelig foreslått. 12 En nysgjerrighet er hvordan konnexinene kan forbli monomere under reisen, og hvorfor de ikke kobler seg sammen med sammenhengende tilkoblinger i tilsluttede intracellulære membraner når de først oppstår. Faktisk, i transfekterte celler som overuttrykker Cx43, observeres slike forbindelsesstrukturer i intracellulære membraner, og det antas at chaperonproteiner, i lav nok overflod til å være mettbare ved connexin -overuttrykk, kan utføre denne funksjonen i normale celler. 1. 3

Bevegelse av koblinger fra den distale Golgi til forbindelsesmembranen forblir mystisk. Et ubesvart spørsmål er om levering er tilfeldig hvor som helst på celleoverflaten, etterfulgt av diffusjon til fanget av høy affinitetsbinding til en tiltalende hemikanal, eller om konneksoner er målrettet mot kryssplater. Det nylige funnet at et PDZ-domene for det tette kryss-assosierte proteinet ZO-1 binder karboksylterminalen til Cx43 og knytter det til det cytoskjelettproteinspektrin ved interkalerte skiver av hjertemyocytter 14 15, gjør det nå mulig å konstruere og teste modeller for å avgjøre om stillaser assosiert med gap junction -proteiner genererer kreftene som aggregerer junctional -kanaler, dirigerer innsetting eller gjenfinning av dem, eller setter modulerende molekyler ved siden av munnene til junctional -kanalene.

Connexins gjennomgår andre typer posttranslasjonelle modifikasjoner, inkludert fosforylering og ubiquitination. 8 Hvor disse modifikasjonene skjer er ikke helt klart, selv om Cx43 kan fosforyleres mens det er i kryssplater, og fosforylering har blitt foreslått for å lette kanaldannelse. 16 Hvorvidt slike modifikasjoner som fosforylering/defosforylering og ubiquitin -inkorporering i Cx43 gir bindingssteder for gjenfinning av konnexinproteiner fra membranen og endelig nedbrytning er ukjent. I artikkelen av Beardslee et al., 1 rapporterer de at selektiv farmakologisk blokkering av enten lysosomale eller proteasomale nedbrytningsveier resulterer i akkumulering av junctional Cx43, noe som indikerer at begge veier normalt bidrar. Et spennende aspekt ved denne studien er at proteasomal inhibering forårsaket akkumulering av defosforylerte Cx43, mens behandling med lysosomale hemmere økte mengden fosforylerte Cx43 som er igjen i forbindelsesmembraner, noe som tyder på at fosforyleringstilstand kan gi et signal for å lede nedbrytningsveien. Det gjenstår å avgjøre om en slik differensial nedbrytning kan være ansvarlig for forkortede halveringstider rapportert for connexin45 mutanter som mangler fosforylerbare serinrester. 17

Internaliserte ringformede gapforbindelser har blitt påvist i dissosierte celler 18 19 20 og mer sjelden i celler som opprettholdes i kultur (f.eks. Se referanse 21 21), og det har blitt antydet at en celle kan nedbryte både konnexinene i sine egne konneksjoner og de fagocytoserte fra nabocellen. 22 Et sekvensielt bidrag av proteasomale og lysosomale nedbrytningsveier kan tillate slik internalisering og brudd på gapekryss. I samsvar med en slik mulighet rapporterte Laing et al 7 at i kinesisk hamster eggstokk og hjerte-avledede BWEM-celler forble Cx43 på overflaten da proteasomet ble hemmet, men dukket opp i intracellulære vesikler da proteasomveien ble blokkert.

Den raske omsetningsdynamikken til gap junction -kanaler innebærer at gap junction -mediert krets i vev kan være en dynamisk prosess som reagerer på lokale krav. Det første eksempelet på et vev der gapforbindelsesuttrykk ble vist å gjennomgå raske endringer var gravid myometrium, 23 der Cx43 -ekspresjon nå er kjent for å være transkripsjonelt oppregulert på arbeidstidspunktet, 24 antagelig virket for å koordinere og derved intensivere sammentrekningene. av livmoren.

Karveggen er et organ som gjennomgår både fysiologiske og patologiske endringer som respons på mekaniske påkjenninger og på eksponering for hormonelle stimuli. Vaskulært vev består av to kommunikasjonsrom: glatt muskel, som hovedsakelig uttrykker Cx43 (f.eks. Se referanse 25 25), og endotelceller, som Gabriels og Paul 2 viser, i uforstyrret aorta, uttrykker overveiende connexin40, noe mindre Cx37, og lite eller ingen Cx43. I kultur har regulering av konnexinuttrykk av vaskulære glatte muskler og endotelceller blitt evaluert med hensyn til en rekke stimuli. For eksempel ble glattmuskelceller nylig vist å svare på 20% statisk strekk med oppregulering av Cx43 og dets mRNA innen timer etter påføring. 26 Dyrede endotelceller har vist seg å oppregulere Cx43 som svar på sår, 27 28 påføring av skjærspenning, 26 og etter behandling med transformerende vekstfaktor-β 29 og grunnleggende fibroblastvekstfaktor, 30 mens ekspresjon av Cx43 har blitt rapportert å synke i respons på epidermal vekstfaktor 31 og tumornekrosefaktor-α. 32 Det er interessant at i de få studiene som enten har målt transkripsjon direkte eller evaluert mRNA -stabilitet gjennom behandling med cykloheksimid, har endotelendringene blitt tilskrevet endret mRNA -stabilitet (f.eks. Se referanser 27, 28 og 33 27 28 33), mens endringene i glatt muskel har vist seg å være transkripsjonelle. 26

Tilsvarende færre in vivo -studier har blitt utført for å evaluere effekter av vaskulære manipulasjoner på konnexinuttrykk, selv om funnene i arterielle glattmuskelceller har vært slående: Cx43 -ekspresjon ble vist å øke i flere hypertensive modeller 34 35 og etter ballongskade, 36 mens redusert Cx43-ekspresjon skyldes hyperkolesterolemi-indusert åreforkalkning. 37

Gabriels og Paul 2 rapporterer at Cx43 praktisk talt er fraværende i de fleste regioner i gnavere -aortaendotel, bortsett fra på steder der forgrening eller strømningsdeling forventes å skape høy turbulens, og at Cx43 -uttrykk er gjensidig relatert til Cx37. Disse observasjonene kan delvis forklare det anatomiske funnet at formene på gap junctions-matrikkene som forbinder endotelceller i områder med vaskulær turbulens er forskjellige enn i regioner med laminær strømning, 38 39 og involvering av en skjærspenningsindusert transduksjonsmekanisme kan også relateres til det rapporterte høye Cx43 -uttrykket i hjertevev under mitralventilen. 40

Gabriels og Paul 2 rapporterer i tillegg at Cx43 -ekspresjon induseres dramatisk i den kappede regionen 8 dager etter påføring av ligering eller en silikonmansjett. Dette er et bemerkelsesverdig funn som antyder en mekanisme der myoendotelial kommunikasjon enten kan etableres eller intensiveres i områder med endret strømning. Sannsynlige konsekvenser av slike endringer i konnexinuttrykk kan inkludere endret vasomotorisk tone eller vaskulær reaktivitet som en kompensasjon eller feil tilpasning til slik skade.

Den raske dynamikken i gap junction -omsetningen og plastisiteten til gap -junction -uttrykk som respons på forskjellige stimuli gir muligheten for remodellering av intercellulære kretsløp både i og mellom kommunikasjonsrom i det kardiovaskulære systemet. I hjertet kan slik ombygging overdrive ledningsdiskontinuiteter på grunn av vevsanisotropi og dermed være arytmogen, 41 og i karveggen kan et slikt endret uttrykk tillate interkompartimentell signalering som ellers er forbudt på grunn av mangel på heterotypisk forbindelsesdannelse av konnexinene som normalt uttrykkes av glatte muskler og endotelceller. 42 Det neste trinnet for å forstå ombyggingen av gap -junction -medierte kretser for intercellulær signalering vil kreve identifisering av cis-virkende elementer og trans-virkende faktorer som er ansvarlige for endret uttrykk for connexin -genene som respons på miljøstimuli. Selv om overraskende få studier så langt har tatt for seg disse kontrollmekanismene (f.eks. Referanse 24 24), vil rapporter som Gabriels og Paul 2 sannsynligvis stimulere flere studier, noe som ikke bare fører til økt forståelse av regulering av connexin -gener, men også til strategier fra hvilke uttrykksmønstre som kan manipuleres terapeutisk.

Meningene som kommer til uttrykk i denne redaksjonen er ikke nødvendigvis de fra redaktøren eller American Heart Association.

Forskning i forfatterlaboratoriet er for tiden finansiert av tilskudd fra National Institutes of Health og Muscular Dystrophy Association. Forfatteren anerkjenner takknemlig samtaler med Dr. Elliot L. Hertzberg i løpet av det siste tiåret som har formet hans forståelse av den biokjemiske naturen til gap junction polypeptider.


Omsetnings- og fosforyleringsdynamikk for connexin43 gap junction protein i dyrkede hjertemyocytter

D W Laird, K L Puranam, JP Revel Omsetnings- og fosforyleringsdynamikk for connexin43 gap junction protein i dyrkede hjertemyocytter. Biochem J 1. januar 1991 273 (1): 67–72. doi: https://doi.org/10.1042/bj2730067

Dyrkede kardiomyocytter ble brukt til å studere omsetning og posttranslasjonell modifikasjon av connexin43 (Cx43), et stort gap-junction-protein i neonatale hjertemyocytter. Immunutfelling av [35S] Met-merkede lysater med anti-Cx43 antistoffer etterfulgt av analyse ved bruk av SDS/PAGE og fluorografi avslørte to bånd, ett ved 40 kDa og det andre ved 42 kDa. Alkalisk fosfatasebehandling av [35S] Met-merket Cx43 eliminerte båndet ved 42 kDa, noe som antydet at det representerte en fosforylerte form av proteinet. Dette ble bekreftet av [32P] P1 -inkorporering i 42 kDa -båndet, men ikke i båndet ved 40 kDa. I tillegg ble en annen alkalisk fosfatasefølsom fosforylert form av Cx43 identifisert ved 44 kDa. I pulsjaktforsøk ble halveringstiden til Cx43 i kardiomyocytter bestemt til å være 1-2 timer. Videre ble det funnet at omsetningshastigheten for fosfatgrupper på Cx43 var eksperimentelt definert av halveringstiden til proteinet. Observasjonen om at fosfatgrupper kan forbli med proteinet gjennom hele livet, er i samsvar med funnet at Cx43 hovedsakelig fosforyleres i isolerte plakater for hjerteklopp for voksne rotter. Vi postulerer at den raske omsetningen av Cx43 og dens flere fosforyleringssteder spiller viktige roller i reguleringen av celle-cellekommunikasjon via gapekryss.


Aktivering av AKT, men ikke connexin43 ubiquitination, regulerer gap junction stabilitet.

Det poreformende gap junctional protein Connexin43 (Cx43) har en kort (1-3 timer) halveringstid i celler i vevskultur og i hele vev. Selv om den er kritisk for mobilfunksjon i alle vev, er prosessen med gap junction-omsetning ikke godt forstått, da behandling av celler med en proteasomal hemmer resulterer i større gap-junctions, men liten endring i totalt Cx43-protein mens lysosomale inhibitorer øker totalt, for det meste ikke-junctional Cx43 . For bedre å forstå omsetning og identifisere potensielle steder for Cx43 ubiquitination, forberedte vi konstruksjoner av Cx43 med forskjellige lysiner konvertert til argininer. Imidlertid, når de ble transfisert inn i celler, opptrådte en mutant versjon av Cx43 med alle lysiner konvertert til argininer på samme måte som villtype i nærvær av proteasomale og lysosomale hemmere som indikerer ubiquitinering av Cx43, og det syntes ikke å spille noen rolle i gapforbindelsesstabiliteten. Gjennom bruk av hemmere og dominerende negative konstruksjoner fant vi at Akt (proteinkinase B) -aktivitet kontrollerte gapforbindelsesstabiliteten og var nødvendig for å danne større stabile gapforbindelser. Akt -aktivering ble økt ved proteasomal inhibering og resulterte i fosforylering av Cx43 ved Akt -fosforyleringskonsensussteder. Dermed konkluderer vi med at uboksinering av Cx43 ikke er nødvendig for regulering av Cx43 -omsetning snarere Akt -aktivitet, sannsynligvis gjennom direkte fosforylering av Cx43, styrer gapforbindelsesstabiliteten. Denne koblingen av en kinase som er involvert i å kontrollere celleoverlevelse og vekst til gapforbindelsesstabilitet, kan mekanisk forklare hvordan gap junctions og Akt spiller lignende regulatoriske roller.


Innhold

Molekylstrukturen til gapforbindelser gjør dem følsomme og reagerer på intercellulære strømmer. [7] Denne følsomheten gjør at kanalen kan endre størrelsen og strukturen i henhold til elektriske signaler. De to typene spenningsport, Vj gating og sakte spenning, er like i sine mekanismer, men reagerer på forskjellige elektriske størrelser. [7] De elektriske signalene som modulerer gapforbindelser frigjør Ca 2+ som induserer en positiv tilbakemelding med spenningsgating. [8] Denne kalsiummodulasjonen påvirkes også av pH og calmodulin. [8]

Mekanismer Rediger

Vj gating Rediger

Vj gating styrer størrelsen på gap junction, og er i stand til å redusere kanalstørrelsen med opptil 40% fra sin helt åpne tilstand. [1] [7] Følsomheten overfor spenning tilskrives i stor grad gapekryssets cytoplasmatiske NH2-terminal som reagerer på små spenninger (2-3mV). [7] [9] Spenningsportmodulering er assosiert med ladningen av connexin positivt ladet connexin nær med hyperpolarisering og negativt ladede connexins nær med depolarisering. [7] Annet enn konneksinladning, reguleres Vj gating også av forskjellige konsentrasjoner av Ca 2+, H + og calmodulin. [8]

Langsom spenning gating Rediger

Langsom spenning gating antas å være lik Vj gating når det gjelder mekanisme, men i motsetning til Vj gating, lukker kanalen helt til en ikke-ledende tilstand. [7] Denne modulasjonen er tregere enn den tidligere gating -metoden, ettersom den forekommer som respons på Vj gating. [7] Den tidsmessige spenningsreguleringen er også utsatt for høyere spenning (10-30mV), [7] forskjellige naturlige faktorer-for eksempel lipofiler og lav pH-og dokking av to hemikanaler. [7] De eksakte mekanismene for både Vj-gating og sakte spennings-gating er fortsatt ukjente, men det er spådd at endring i ladning får det cytoplasmatiske NH2-terminale domenet til å bevege seg mot cytoplasma for å redusere porestørrelsen. [7]

Faktorer Rediger

Kalsiumredigering

Kalsium finnes i organismer i form av ionet, Ca 2+, og er en effektiv modulator av gapekryss, som har et nært forhold til spenningsport. En økning i intracellulær kalsiumionkonsentrasjon med over 500nM får permeabiliteten til plasmamembraner til å synke raskt. [5] Denne modulasjonen via kalsium er kjent for å være beskyttende, da den forhindrer døde celler i å indusere apoptose i naboceller. [10] Likevel er høy Ca 2+ konsentrasjon sjelden sett, da denne gating-metoden er selvhemmende. [8] Ca 2+ konsentrasjoner er en avgjørende bestemmende faktor for spenningsporten, ettersom tilstrømningen og bevegelsen av Ca 2+ er nødvendig for depolarisering. [8]

PH Rediger

Gapforbindelsens permeabilitet påvirkes ytterligere av miljøets pH. PH-følsomheten avhenger av typen konnexin som utgjør gapforbindelsen, men kanalene lukkes generelt ved en pH på 6,4-6,2. [8] [10] Under svake sure forhold observeres gapforbindelsens kanaler å forbli stengt til tross for spenningsendringer, mens kanalene under sterke sure forhold åpnes med spenning, men lukkes umiddelbart.

Rapporter indikerer videre et synergistisk forhold mellom hydrogenioner og den intracellulære konsentrasjonen av kalsium for å redusere permeabiliteten i gapforbindelsen. [8] [10] Studier på hjerteceller bemerket at acidose, redusert pH i seg selv hadde en begrenset effekt for å redusere fargestoffdiffusjon mellom cellene. Reduksjonen ble betydelig forhøyet med en økning i intracellulær kalsiumkonsentrasjon. [8]

Calmodulin Rediger

Calmodulin (CaM) er et protein sammensatt av 148 aminosyrer som spiller både en mellommann og en direkte rolle i å moderere gapforbindelser. [6] [8] Calmodulin fungerer som en regulator på membrankanaler inkludert både små og mellomliggende Ca 2+ -aktiverte kaliumionkanaler, L-type Ca 2+ kanaler, P/Q-type Ca 2+ kanaler og natriumionkanaler. [8] Alle disse membrankanalene kan ytterligere påvirke kationkonsentrasjoner, bestemme den elektrokjemiske gradienten til cellemembranen og påvirke spenningsporten. [8]

Calmodulin virker også direkte på gapekryss gjennom sine to Ca 2+ bindingssteder. [8] [10] Med bindingen av Ca 2+ går calmodulin gjennom en konformasjonsendring som til slutt blokkerer gapforbindelsens kanal, og forhindrer passasje av cytoplasmatisk materiale. [8] På samme måte, mens inhibering av calmodulin-ekspresjon øker sannsynligheten for gap-junction-lukking, fremmer CaM-antagonist og CaM-blokkere åpningen av gap-junctions. [5] [8]

Kjemisk modifikasjon finner sted på connexin -proteiner etter oversettelsen og innebærer vanligvis endringer i fosforylering og ubiquitinering, selv om nitrosylering, deamidering og hydroksylering også er blitt notert som modifiserende prosesser. [10] Implikasjonene av kjemisk modifikasjon varierer sterkt avhengig av funksjonell gruppe eller protein som ble tilsatt og konnexinproteinene involvert. [10] Vanligvis skjer endringene i utviklingen og livssyklusen til konnexinproteinet eller i porten og strukturen til gapekryssene selv. [10]

Mekanismer Rediger

Phosphorylation Edit

Phosphorylation, the addition of a phosphate group, plays an important role in regulating both gap junctions and the subunits that form them. The gap junction protein connexin generally possesses a number of phosphorylation sites (connexin Cx43 has 21). [11] [12] The binding of phosphate to these sites can bring about various effects that influence aspects of the protein’s lifecycle. [11] For example, phosphorylation of Cx43’s phosphorylation sites promote its trafficking from the Golgi apparatus to the plasma membrane. [11] The subsequent oligomerization of this protein into hemichannels and the hemichannels into gap junctions is also induced by phosphorylation. [12] Likewise, degradation can be initiated by phosphorylation as well as changes in gating, which determines the permeability of gap junctions. [1. 3]

Phosphorylation of gap junctions and their subunits is typically achieved through protein kinases, enzymes that add phosphates to the amino acids of proteins. [11] [12] [13] Serine/threonine kinases, which phosphorylate the hydroxyl group of serine or threonine residues, form the bulk of the Connexin phosphorylation kinases. These include protein kinase C (PKC), protein kinase G (PKG), Ca2+/calmodulin-dependent kinase II (CaMKII), cAMP-dependent protein kinase A (PKA), MAP kinase (MAPK) and casein kinase (CK). [11] Kinase Src is the lone Tyrosine kinase that has been observed to phosphorylate connexins. [11] Protein kinases vary in their targeted connections, specific sites of phosphorylation and phosphorylation effect. [11]

For example, PKA phosphorylation impacts both hemichannel and connexin activity. [11] Here, neuronal hemichannel activity is suppressed by reducing permeability while connexins are affected by an increased trafficking and assembly into gap junctions. PKA activity is largely associated with an increased cAMP concentration. [11] On the other hand, PKB phosphorylation can prevent the binding of the zonula occludens-1 protein, resulting in an increased gap junction size and hemichannel permeability. [11] Its activity is usually in response to physiological changes such as wounding or hypoxia. [11]

Ubiquitination Edit

Ubiquitin is a small, long lived, globular protein that covalently bonds to lysine residues of target proteins in a process known as ubiquitination. [14] Much like phosphorylation, it acts as a post-translational regulator for many proteins including connexin. [14] Ubiquitination has been observed to be most involved in the final stages of the connexin protein’s lifecycle, regulating both Gap junction endocytosis and Connexin degradation. [15] However, details of specific pathways and involved proteins are still being studied.

The distinct effects of ubiquitination tend to vary widely, depending on the tissues and subcellular location where it occurs and the type of ubiquitin involved. [15] For example, newly synthesized Cx43 in the endoplasmic reticulum can undergo polyubiquitination, resulting in recognition by proteasomes that carry out endoplasmic reticulum associated protein degradation (ERAD). [15] Ubiquitination of Cx43 that is at the plasma membrane and organized into gap junctions will result in internalization, or endocytosis, followed by degradation of Cx43 by lysosomes. [15]

Nitrosylation Edit

Nitrosylation, the addition of a Nitric oxide (NO) group, has been demonstrated to have a substantial role in causing post translational modifications of both gap junction proteins and hemichannels. [16] Nitrosylation can either be induced on the connexin proteins or proteins that further regulate connexin such as kinases. The type of nitrosylation that occurs is S-nitrosylation, the addition of a nitric oxide group to a cysteine thiol of a protein. [17]

Experiments regarding S-nitrosylation and the lifecycle of gap junctions suggest it has a role in regulating hemichannel trafficking and gap junction formation addition of NO rapidly increased the level of Cx40 and Cx43 connexin at the plasma membrane as well as the formation of gap junctions in endothelial cells. [17] The mechanism behind this phenomena is still unknown but the pro oxidant conditions induced by NO is thought to modulate the properties of the Golgi apparatus which is responsible for modifying and sorting proteins. [17]

Arrhythmogenic cardiomyopathy Edit

Electrical coupling among cardiac cells is crucial for a healthy heart, allowing the cardiac muscle fibers to contract normally. This coupling is done by gap junctions. [18] Gap junctions permit the passive diffusion of materials–such as ions–across the cytoplasm of one cell to another this junction enables proper propagation of electrical impulses along cardiac cells. [18]

The genetic cardiac disease, Arrhythmogenic Cardiomyopathy (ACM), is marked by the reduced expression/number of the heart’s gap junctions, which can further lead to impaired function and ventricular arrhythmia. [18] This disease results from an altered expression of proteins, including Neural Cadherin (CDH2) and Plakophilin-2 (PKP2), which naturally promote gap junction expression. [18] Decreased CDH2 is found to reduce the expression of connexin 43 (Cx43), a major protein that promotes gap junction synthesis, further leading to a reduced conduction velocity of electrical impulses. [18] Decrease in PKP2 also limits Cx43 expression, but only with a concurrent decrease in the reduction of N-Cadherin. [18]

Liver diseases Edit

As gap junctions have a major role in regulating the homeostasis of the liver, an abnormal expression of gap junctions can be a major contributor towards liver failure. [19] Taking cirrhosis and acute liver failure (ACLF) for examples, an increased expression of hepatic connexin 43 is associated with severe inflammation. [19] Conditions are worsened as the increased expression of Cx43 rapidly propagates death signals to neighboring cells, causing them to undergo apoptosis. [19]

Gastrointestinal diseases Edit

Just as with the heart, gap junctions play a significant role in mediating electrical signals within the intestines. [20] Electrical signals are necessary for the synchronization of smooth muscles, buffering substrate concentrations, and mediating inflammation. [20] As such, dysfunction of gap junctions leads to numerous symptoms such as gastrointestinal infections and inflammatory bowel disease. [20]

The pathogenesis of gap junctions varies between diseases. For inflammatory bowel disease, a decrease in gap junction expression disrupts junctional complexes among intestinal cells, leading to symptoms such as diarrhea and internal cramps. [20] Less is known about the mechanism behind the pathogenesis of gap junctions in gastrointestinal infections, but the correlation is clear: infections are marked with increased Cx43 levels and their abnormal localization. [20]


Se videoen: Ine Sinthya - Jurang Perpisahan Official Music Video (August 2022).