Informasjon

Blackgram blader. SDS -side. Fosfatbuffermetode

Blackgram blader. SDS -side. Fosfatbuffermetode



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Jeg gjør proteinanalyse i blackgram -blader ved å bruke fosfatbuffermetode. Men jeg kan ikke få ordentlige band på SDS-PAGE. Hva skal jeg gjøre for å få skikkelige band?


Du bør fjerne flekker på gelen din lenger. Jeg kan se minst ett tykt bånd på toppen, men uten avflekking lenger mangler du sannsynligvis andre svakere band.

Forklar også hva du mener med "riktige band". Den øverste ser bra ut for meg. Det kan være andre, men vi kan ikke se dem.


Evaluering av proteinekstraksjonsmetoder for Vitis vinifera Blad- og rotproteomanalyse ved todimensjonal elektroforese

En effektiv proteinekstraksjonsmetode er avgjørende for å sikre vellykket separasjon ved todimensjonal elektroforese (2-DE) for motstridende plantearter, spesielt for vinranker (Vitis vinifera L.). Trikloreddiksyre-aceton (TCA-aceton) og fenolekstraksjonsmetoder ble evaluert for proteomanalyse av blader og røtter fra den tunisiske kulturen 'Razegui'. Den fenolbaserte protokollen viste seg å gi et høyere proteinutbytte, en større flekkoppløsning og en minimal striper på 2-DE-geler for både blad- og rotvev sammenlignet med den TCA-baserte protokollen. Videre ble det høyeste antallet påviste proteiner på 2-DE-geler observert ved bruk av fenolekstraksjon fra blader og røtter sammenlignet med TCA-acetonekstraksjon.


Tilgangsalternativer

Få full journaltilgang i 1 år

Alle priser er NETTO -priser.
MVA blir lagt til senere i kassen.
Skatteberegningen vil bli fullført under kassen.

Få tidsbegrenset eller full artikkeltilgang på ReadCube.

Alle priser er NETTO -priser.


Lysebuffer for nukleinsyrer

Lysering av celler for ekstraksjon av nukleinsyrer er på noen måter mye enklere enn ekstraksjon av proteiner. Nukleinsyrer er mye mer motstandsdyktig mot denaturering enn de fleste proteiner, så en denaturerende lyseringsbuffer kan brukes. Type lyseringsbuffer avhenger av typen nukleinsyre, for eksempel genomisk, mitokondrielt eller plasmid -DNA, og total eller subtraksjon av RNA, samt cellekilden.

Å skaffe intakt RNA er mer krevende enn å isolere DNA, på grunn av tilstedeværelsen av RNaser. Cellelysebuffer for RNA -ekstraksjon er svært denaturerende og består vanligvis av fenol og guanidinisotiocyanat. RNase -hemmere er vanligvis tilstede i lyseringsbufferen, siden RNaser kan være svært motstandsdyktige mot denaturering og forbli aktive.

For ekstraksjon av DNA vil lyseringsbufferen vanligvis inneholde SDS. I de fleste sett for plasmidekstraksjon vil bufferen inneholde så vel natriumhydroksid som SDS, for alkalisk lysis. Tilsetningen av kaliumacetat til denne lyseringsbufferen tillater renaturering av plasmid -DNA, men ikke det bakterielle DNA, som utfelles.

Siden cellelyse og ekstraksjon av nukleinsyrer ikke er gjenstand for så mange variabler som for proteiner, kan de fleste nukleinsyreekstraksjoner utføres med ett av få sett. Kittene inneholder vanligvis en cellelysebuffer og en passende nukleinsyre og bindemiddel.

Bio-Rad tilbyr en rekke sett for forberedelse og rensing av nukleinsyreprøve, alt inkludert en cellelysebuffer optimalisert for hvert sett: total RNA-isolasjon fra forskjellige celletyper, plasmid og genomisk DNA-ekstraksjon, agarosegelekstraksjon og opprydding av radiomerkede sonder , nick -oversettelser, plasmid og PCR -reaksjonsblandinger.


Resultater

Rå ekstrakter

Proteinkonsentrasjonen av råekstrakter fra antenneknollen av Dioscorea bulbifera ekstrahert ved forskjellig temperatur og varierende pH er som vist i figur 1. Resultatet viste at maksimal proteinkonsentrasjon ble oppnådd ved pH 8,3 og ved romtemperatur, 25 ° C.

Proteinkonsentrasjon av råekstraktene av Dioscorea bulbiferaen ved forskjellig temperatur og b ved forskjellig pH

Rensing av lagringsprotein

Det rå ekstraktet fra antenne -knollen av Dioscorea bulbifera (379,60 mg) når den ble utsatt for 70% ammoniumsulfatutfelling ga 130,80 mg protein som tilsvarer 34,46% utbytte. Elueringsprofilen for ionebytterkromatografien på DEAE-Sepahdex A-25 i den dialyserte proteinprøven er som vist i figur 2a. To proteintopper ble oppnådd fra DEAE-Sephadex A-25-kolonnen, en ikke-adsorbert topp og den adsorberte proteintoppen som ble eluert med 150 mM NaCl. Den adsorberte toppen som ble slått sammen og renset ytterligere ved gelfiltrering på Sephadex G-75-kolonnen er som vist i figur 2b. På slutten av rensingen var mengden protein som ble gjenvunnet 13,20 mg, tilsvarende 3,48% av utgangsmaterialet.

Kolonnekromatografiprofil av Dioscorea bulbifera.en Ionbytningskromatografi av dialysert 70% ammoniumsulfatutfelling av ekstraktet fra antenne Dioscorea bulbifera på DEAE Sephadex A-25 kolonne (elueringsbuffer: 0,05 M Tris-HCl buffer pH 8,3. Adsorbert protein ble eluert med 0,05 M Tris-HCl buffer pH 8,3, inneholdende 150 mM NaCl). Kolonnestørrelse (1,5 × 20) cm strømningshastighet 15 ml/t brøkstørrelse 5 ml. b Gelfiltrering av adsorbert topp fra ionebytter på Sephadex G-75 kolonne (elueringsbuffer: 100 mM Tris-HCl pH 7,9 med 100 mM NaCl). Kolonnestørrelse (1,5 × 40) cm strømningshastighet 27 ml/t brøkstørrelse 3,6 ml

Molekylvekt på D. bulbifera lagringsprotein

Molekylvekten til det opprinnelige lagringsproteinet til antenneknollen av D. bulbifera som bestemt ved gelfiltrering på Bio-gel P-100 var 22 000 Da. Subenhetens molekylvekt, som ble bestemt av SDS-PAGE under denaturerende forhold, ble estimert til 21.095 Da (fig. 3).

Elektrogram av SDS-polyakrylamidgelelektroforese av lagringsproteinet til antenneknollen i D. bulbifera. PAGE ble utført i nærvær av SDS ved bruk av det diskontinuerlige Tris-glycin-buffersystemet. Separasjonsgelen var 10%, og stablingsgelen var 3,5% akrylamid. Andre forhold var som beskrevet i teksten. Bane A: standardproteiner B: gelfiltreringsfraksjoner C: ionebytter -sammenslåtte fraksjoner D: ammoniumsulfatutfelling E: råekstrakt

Påvisning av proteinbundet karbohydrat

Lagringsproteinet til antenne-knollen farget ikke lilla-rødt med Schiffs reagens som antyder at det ikke har noe kovalent koblet karbohydratmolekyl og dermed ikke er et glykoprotein.

Aminosyresammensetning

Aminosyresammensetningen til lagringsproteinet til antenneknollen av D. bulbifera er presentert i tabell 1. Aminosyresammensetningen er preget av en overflod av nøytrale og ladede polare aminosyrer, spesielt tyrosin, arginin, glutamat og cystein, som utgjorde omtrent 58% av den totale konsentrasjonen av aminosyrer i proteinet (g/100 g protein). Blant de upolare aminosyrene var prolin og fenylalanin tilstede i relativt høy konsentrasjon. Av de svovelholdige aminosyrene var konsentrasjonen av cystein høyere sammenlignet med metionin. Tryptofan, som sannsynligvis ble ødelagt under sur hydrolyse av proteinet, ble ikke påvist.

Karbonsyreanhydraseaktivitet

Proteinet hadde lav karbonsyreanhydraseaktivitet (0,202 enheter/mg) sammenlignet med standard karbonsyreanhydrase fra bovine erytrocytter.

Dehydroaskorbatreduktaseaktivitet

Lagringsproteinet til antenneknollen av D. bulbifera viste dehydroaskorbatreduktaseaktivitet. Proteinet var i stand til å regenerere askorbat fra dehydroaskorbat i nærvær og fravær av glutation som vist i figur 4a, b. I nærvær av glutation var de spesifikke aktivitetene til dehydroaskorbatreduktase for proteinet henholdsvis 4,14 og 6,01 μmol askorbinsyre/min/mg protein ved pH 6,5 og pH 7,0. I fravær av glutation var de spesifikke aktivitetene henholdsvis 2,07 og 2,76 μmol askorbinsyre/min/mg protein ved pH 6,5 og pH 7,0. Ingen aktivitet ble observert ved pH 6,0.

Dehydroaskorbatreduktaseaktivitet av lagringsprotein fra antenneknollen av D. bulbifera ved pH 6,5 og 7 med (en) eller uten (b) 4 mM glutation og (c) monodehydroaskorbatreduktaseaktivitet av lagringsproteinet til antenneknollen av D. bulbifera ved pH 6, 6,5 og 7

Monodehydroaskorbatreduktaseaktivitet

Lagringsproteinet fra antenneknollen av D. bulbifera viste monodehydroaskorbatreduktaseaktivitet. Proteinet reduserte monodehydroaskorbat til askorbat kombinert med NADH -oksidasjon. Ved pH 6,0 var aktiviteten 0,0017 enheter/mg, noe som innebærer at mengden protein som kreves for å oksidere 1 μmol NADH per minutt ved pH 6,0 var 0,0017 enheter/mg. Ved pH 6,5 og pH 7,0 var aktiviteten henholdsvis 0,00038 enheter/mg og 0,00051 enheter/mg. Monodehydroaskorbatreduktaseaktivitet var høyere ved pH 6,0 enn ved annen pH som vist i figur 4c.

Trypsin -hemmende aktivitet

Ulike mengder av proteinet ble brukt til å bestemme trypsininhiberende aktivitet, og aktiviteten ble uttrykt som mikrogram trypsinhemmet som vist i figur 5. En positiv korrelasjon (r 2 = 0,9752) ble funnet mellom trypsininhiberende aktivitet og mengder lagringsprotein fra antenneknollen D. bulbifera. Lagringsproteinet til antenneknollen av D. bulbifera viste lav trypsininhiberende aktivitet med et gjennomsnitt på 0,94 μg trypsin hemmet per 100 μg av proteinet.

Trypsininhiberende aktivitet av det store lagringsproteinet i antenneknollen av D. bulbifera

Tilstedeværelse av dioscorin -gener

Screening av primersettene designet for studien med genomiske DNA -prøver avslørte at noen av de spesifikke primerne var i stand til å påvise dioscorin -genet i den genomiske DNA -prøven til Dioscorea bulbifera. Målsekvenser oppnås lett ved polymerasekjedereaksjon hvis flanksekvensene til målsekvensene er kjente. Tilstedeværelsen av dioscorin -genet ble dermed etablert i det genomiske DNA ekstrahert fra antenneknollen av Dioscorea bulbifera. Sekvensanalyse av dioscorin gen DNA-markør produserte to DNA-fragmenter og nukleotidsekvensstørrelser som var henholdsvis DBSPOOA1-556 bp og DBSPOOA2-913 bp (fig. 6a).

en PCR -forsterkning av D. bulbifera Dioscorin-gener (DBSPOOA) med Dioscorin-spesifikt primersett (5′-CTCCTCTCCTCCCTCCTCTT-3 ′ og 5′-GGGGGTACAATGGAGAAGTG-3 ′). PCR -produkter ble løst på agarosegeler og farget med etidiumbromid. Den siste banen viser DNA -stige som inneholder DNA -fragmenter med definert lengde for dimensjonering av båndene i de eksperimentelle PCR -ene. Båndene skissert i grønt og rødt representerer henholdsvis DBSPOOA1 og DBSPOOA2. b Fylogenetisk forhold mellom DBSPOOA -gener og andre Dioscorin -gener

Homologe likheter mellom gener og sekvensjusteringer

BLAST-homologisøk ved bruk av nukleotidsekvens av DBSPOOA1-556 ga signifikante justeringer av 100% nukleotididentitet med Dioscorin B fra Dioscorea alata (dioB-1), 96% nukleotididentitet med Dioscorea oppositifolia mikrosatellitt Dios23 -sekvens og 88% nukleotididentitet med Arabidopsis thaliana kromosom 3. DBSPOOA2-913 ga signifikante justeringer av 91% nukleotidjustering med D. alata bilag GZY109 ribulose-1,5-bisfosfatkarboksylase stort underenhet (rbcL) gen og 81% nukleotididentitet med D. japonica bilag Hsu 231 ribulose-1,5-bisfosfatkarboksylase stort underenhet (rbcL) -gen (tabell 2).

BLAST-homologisøk ved hjelp av oversatte aminosyresekvenser fra nukleotidsekvensene til DBSPOOA1-556 og DBSPOOA2-913 produserte også sekvenshomologi med kjente proteinsekvenser fra Dioscorea spp. DBSPOOA1-556 konseptuell aminosyresekvens har 75% aminosyresekvensidentitet med Dioscorin B fra D. alata, 73% identitet med den forutsagte anionkanalen av S-typen SLAH1-lignende fra Solanum tuberosum (potet), 71% identitet med det hypotetiske proteinet OsJ_01095 av Oryza sativa Japonica (ris) gruppe, 68% identitet med S-type anionkanal SLAH1 av A. thaliana og 60% aminosyresekvensidentitet med lagringsproteinet av Dioscorea cayenensis. Minste molekylvekt beregnet ut fra oversatt sekvens av DBSPOOA1-556 ved bruk av Protparam online server (https://web.expasy.org/protparam/) er 20 456,38 Da, som ligner på det som ble oppnådd for underenhetens molekylvekt av lagringsproteinet av SDS-PAGE (21.095 Da). DBSPOOA2-913 konseptuell aminosyresekvens viste også homologi med andre kjente proteiner, for eksempel ribulose-1,5-bisfosatkarboksylase/oksygenase stor underenhet av D. bulbifera, antatt karbonanhydrase av Neosartorya fischeri og antatt Dioscorin fra O. sativa Japonica gruppe (tabell 3).

Forholdet mellom lagringsproteingenet fra antenneknollen av D. bulbifera (DBSPOOA1-556 og DBSPOOA2-913) oppnådd i denne studien og lagringsproteingenene fra andre Dioscorea spp. ble avslørt ved CLCBio homologi nukleotidsekvensjustering uvektet pargruppe metode aritmetisk (UPGMA) analyse. Analysen avslørte at DBSPOOA1-556 og DBSPOOA2-913 er tydelig forskjellige. Imidlertid dannet DBSPOOA1-556 en klynge med andre Dioscorin-gener fra forskjellige Dioscorea spp. fra asiatiske land, men DBSPOOA2-913 var tydelig forskjellig fra alle kjente Dioscorin-gener som vist i figur 6b.


Diskusjon

Denne studien gir den proteomiske analysen av lysosomale membranproteiner utsatt for melanin i HeLa -celler. For å behandle eller avfarge melanin, må lysosom komme nær det. Følgelig vil vi gjerne vite hvordan lysosomet nærmer seg melaninet. Fordi lysosomene forårsaket å redusere melanin av lysosomale enzymer, men det er ikke mulig å kontakte den uten at lysosomal membran har målrettingsfunksjon. I dette eksperimentet analyserte vi de oppregulerte og nedregulerte lysosomale membranproteinene etter å ha eksponert 100 ppm melanin med 2 DE. Dette resultatet viste 14 oppregulerte og 13 nedregulerte flekker. Her klassifiserte vi oppregulerte (1,5 ganger) og nedregulerte (2,0 ganger) flekker, fordi det er det viktigste som fant oppregulerte flekker, men nedregulerte flekker vil også bli ansett å ha mulighet for tilstrekkelig bruk. Derfor indikerer resultatene våre at lysosomale membranproteiner muligens påvirker å behandle eller avfarge mengden melanin som er eksponert i lysosom på grunn av målrettet evne til dem. Dette antyder at hvis de oppregulerte flekkene bruker, er det mulig å være som biomarkører. Og så kan det være nyttig på medisinske felt som hudkreft og kosmetikk som å misfarge huden.


Introduksjon

Affinitetskoder og andre typer genetisk manipulerte fusjonspartnere er mye brukt som verktøy i molekylærbiologi. Selv om disse opprinnelig ble utviklet for å lette påvisning og rensing av rekombinante proteiner, har det de siste årene blitt klart at visse tagger også kan forbedre utbyttet, forbedre løseligheten og til og med fremme riktig folding av fusjonspartnerne. Styrker og svakheter ved forskjellige tagger har blitt vurdert nylig 1,2,3. Som uløseligheten av rekombinante proteiner, spesielt i Escherichia coli, er en viktig flaskehals i produksjonen av bioaktivt materiale for strukturelle og funksjonelle studier 4, har bruken av løselighetsforbedrende koder for å unngå dannelse av uoppløselige proteinaggregater raskt blitt populær.

Selv om mange proteiner som er svært løselige når de overproduseres E coli har blitt rapportert å ha løselighetsforbedrende egenskaper som fusjonspartnere, i de fleste tilfeller er bevisene som støtter disse påstandene knappe 1. Ikke alle høyt oppløselige proteiner kan fungere som løselighetsforbedrende midler, så det er en feil å anta at disse to egenskapene kan likestilles. Likevel er to proteiner med en meget godt etablert evne til å fungere som løselighetsforbedrende midler E coli maltosebindende protein (MBP) og NusA 5,6. Mekanismene som disse to proteinene øker løseligheten til deres fusjonspartnere er ikke godt forstått, men kan være like 7.

Blant de kjente løselighetsforbedrende fusjonspartnerne er MBP unik ved at den også er en naturlig affinitetskode. MBP -fusjonsproteiner kan renses ved bruk av amylose -affinitetskromatografi 8. Imidlertid har vi og andre observert at MBP -fusjonsproteiner ofte ikke binder effektivt til amyloseharpiks, og at selv når de gjør det, produserer denne typen affinitetskromatografi ikke rutinemessig prøver med tilfredsstillende renhet 3,9,10.

Vi har tidligere vist at det å legge til en polyhistidin -tag (His6) til N-terminalen til MBP forstyrrer ikke dens evne til å fremme løseligheten og riktig folding av sine fusjonspartnere 11. Immobilisert metallaffinitetskromatografi (IMAC) ved bruk av His6-merkede proteiner har vist seg å være en veldig kraftig metode for proteinrensing og brukes rutinemessig av alle de store struktur-genomiske sentrene. Derfor, ved å kombinere His6 og MBP -tagger, er det mulig å utnytte de unike fordelene med hver. MBP -delen tjener til å forbedre løseligheten og fremme riktig folding av fusjonspartnerne, og His -taggen letter deres renselse til homogenitet via en helt generisk protokoll.

Eksperimentelt design

Denne protokollen beskriver hvordan (i) konstrueres en dobbel His6-MBP (HisMBP) -merket fusjonsproteinuttrykkvektor ved Gateway rekombinasjonsk kloning (ii) gjennomføre et piloteksperiment for å vurdere utbyttet og løseligheten av det rekombinante proteinet både før og etter intracellulær prosessering av fusjonsproteinet av tobakk ets virus (TEV) protease og (iii) rense målproteinet i stor skala for strukturelle eller funksjonelle studier.

Gateway-kloningsteknologi benytter de stedsspesifikke rekombinasjonsreaksjonene som formidler integrering og eksisjon av bakteriofag-lambda inn i og fra E coli kromosom, henholdsvis. For mer detaljert informasjon om dette systemet oppfordres etterforskeren til å konsultere teknisk litteratur levert av Invitrogen (http://www.invitrogen.com/content/online%20seminars/gateway/gatewayhome.html). Gateway rekombinasjonell kloning, som er omtalt i denne protokollen, letter konstruksjonen av HisMBP -fusjonsvektorer i stor grad ved å eliminere behovet for restriksjonsendonukleaser og DNA -ligase. Imidlertid kan alternative metoder for kloning, slik som ligeringsuavhengig kloning, også brukes, forutsatt at egnede vektorer er tilgjengelige 12.

For å konstruere en HisMBP-fusjonsvektor ved rekombinasjonell kloning, er det nødvendig å generere et PCR-amplikon der den åpne leserammen (ORF) av interesse er flankert av attB1 og attB2 rekombinasjonsseter på henholdsvis N- og C-terminalene. Et anerkjennelsessted for TEV-protease blir også lagt til mellom attB1-stedet og N-terminalen til ORF. PCR-amplifikasjonen utføres med to overlappende N-terminale primere og en enkelt C-terminal primer, som skissert i figur 1. To genspesifikke primere (N1 og C) er nødvendig for hver ORF. Den overlappende N-terminale primeren (N2) kan brukes til å legge attB1-rekombinasjonsstedet til N-terminalen til en hvilken som helst ORF som TEV-protease-gjenkjenningsstedet allerede er lagt til.

To genspesifikke PCR-primere (N1 og C), med konstante regioner angitt, brukes i forbindelse med en fast primer (N2) som annealer til gjenkjenningsstedet for tobakketsevirus (TEV) og legger attB1-rekombinasjonsstedet til N- enden av ORF. Det resulterende PCR -amplikonet er egnet for bruk som et substrat i BP Gateway -reaksjonen.

For å lage HisMBP-fusjonsvektoren, blir PCR-produktet først rekombinert av Gateway-kloning i donorvektoren pDONR221 for å gi en inngangsklo-mellomprodukt (BP-reaksjon), og deretter til pDEST-HisMBP (LR-reaksjon) for å generere HisMBP-fusjonsproteinuttrykkvektoren (Fig. 2). BP- og LR -reaksjonene er analoge med rekombinasjonsreaksjonene som medierer henholdsvis integrasjon og eksisjon av bakteriofag -lambda -genomet fra E coli kromosom. Både positivt (antibiotikaresistens) og negativt (sletting av det dødelige ccdB gen) seleksjoner benyttes for å sikre at riktig rekombinasjonsprodukt oppnås med høy effektivitet.

I det første trinnet (BP -reaksjon) blir PCR -amplikonet (fig. 1) rekombinert med donorvektoren pDONR221 for å gi opphav til en inngangsklo -mellomprodukt. Inngangsklonen kan utvinnes fra kanamycinresistente transformanter av DH5α-celler, hvis ønskelig (se trinn 8). Alternativt kan den andre rekombinasjonsreaksjonen (LR-reaksjonen), som innebærer overføring av ORF fra inngangsklonen til målvektoren (pDEST-HisMBP), utføres umiddelbart etter at BP-reaksjonen er fullført, og derved omgå isolasjonen av en entry klon mellomprodukt, som beskrevet i denne protokollen (trinn 4–15).

Før storskala cellevekst og rensing av målproteinet, er det tilrådelig at et småskala pilotforsøk utføres for å samle inn viktig informasjon. For det første, er løseligheten til HisMBP -fusjonsproteinet tilstrekkelig? For det andre, kan fusjonsproteinet spaltes effektivt av TEV -protease? For det tredje, forblir målproteinet oppløselig etter at det er separert fra HisMBP -gruppen? Hvis svarene på noen av disse tre spørsmålene er negative, er det lite poeng i å skalere opp prosedyren uten først å prøve å feilsøke (se tabell 1). De to sistnevnte spørsmålene besvares ved bruk av separate plasmidvektorer for å uttrykke TEV -protease sammen med fusjonsproteinet E coli. Produksjonen av fusjonsproteinsubstratet og produksjonen av TEV-protease induseres av henholdsvis isopropyl-β-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) og anhydrotetracyklin. Vi har observert at forsinkelse av induksjon av TEV -protease i 2 timer etter induksjon av fusjonsproteinet ofte forbedrer løseligheten av målproteinet etter TEV -fordøyelse in vivo 13 .


RESULTATER

Som tidligere vist hos andre plantearter (Wedel et al., 1997 Scheibe et al., 2002), kan GAPDH/CP12/PRK-komplekser påvises i Arabidopsis ved gelfiltrering av NAD-behandlede kloroplastproteiner. GAPDH- og PRK-aktiviteter coeluterte ved høy molekylær masse (600 x 02013750 kD) sammen med et 20 kD protein gjenkjent av antistoffer som er dannet mot spinat CP12 (data ikke vist). Disse fraksjonene vil sannsynligvis inneholde en blanding av komplekser av lignende størrelse, inkludert A4-GAPDH/CP12/PRK, A2B2-GAPDH/CP12/PRK og A.8B8-GAPDH -oligomerer (Scheibe et al., 2002). For å studere GAPDH/CP12/PRK -komplekset i et forenklet system, prøvde vi å rekonstruere det supramolekylære komplekset fra isolerte rekombinante komponenter.

Uttrykk, rensing og redoksegenskaper for Arabidopsis rekombinant GAPDH, CP12 og PRK

Hver enkelt komponent i GAPDH/CP12/PRK -komplekset ble heterologisk uttrykt i Escherichia coli. For enkelhets skyld ble GAPDH uttrykt som det enkleste isozymet som kun består av A-underenheter (GapA). Rekombinant GapA av Arabidopsis ble renset til det viste et enkelt bånd på 36 kD i SDS-PAGE (fig. 2A). Renset GapA var redoksfølsomt ved behandling med tioredoksiner, men ble funnet å bli inaktivert av oksidert ditiotreitol (DTT) og andre oksidanter, inkludert H2O2. Denne effekten kunne ikke tilbakeføres av reduktanter og syntes å være avhengig av irreversibel oksidasjon av katalytisk essensielle Cys-149 (M. Zaffagnini og S. Lemaire, personlig kommunikasjon).

SDS-PAGE av GapA, PRK og CP12 av Arabidopsis uttrykt i E coli og renset til homogenitet. Geler ble farget med Coomassie Brilliant Blue R-250. A, GapA og PRK ble behandlet med prøvebuffer inkludert reduktant (5 m m DTT) og lagt på en 12,5% polyakrylamidgel. B, redusert (rd) og oksidert (oks) CP12 -prøver ble oppnådd ved inkubasjon i 2 timer ved 25 ଌ med ekvimolære konsentrasjoner av henholdsvis forhåndsredusert eller preoksidert tioredoksin (se "Materialer og metoder"). Prøver ble deretter kokt i 3 minutter i prøvebuffer uten reduktanter, og proteinene ble separert på 15% polyakrylamidgeler. Tioredoksin migrerte under 14,4 kD-markøren. Den tilsynelatende molekylmassen til CP12 (pilspisser) skiftet fra 20 til 16 kD avhengig av redoksforhold.

Selv om spinat PRK ble rapportert å være motvillig til uttrykk som et aktivt enzym i E coli (Brandes et al., 1996), omtrent 2 mg aktiv Arabidopsis PRK per liter væskekultur ble rutinemessig oppnådd når bakterieceller ble dyrket ved 30 x x 0b0C. Renset PRK migrerte som et enkelt 38 kD bånd i SDS-PAGE (fig. 2A). Redoksfølsomhet for Arabidopsis PRK viste et midtpunkts redokspotensial på � mV ved pH 7,9, innenfor området Em målt for PRK av andre plantearter (Hirasawa et al., 1999 Hutchinson og Ort, 2000). Gjenværende aktivitet av enzymet ekvilibrert med oksidert DTT og tioredoksin sto for 25% av aktiviteten til det fullt reduserte enzymet (se fig. 4).

GapA og PRKs aktiviteter som frie enzymer, som enzymer innebygd i komplekser, og etter kompleks behandling med flere potensielle effektorer. A, aktivitet uttrykt som prosentandel av full aktivitet av gratis tetramerisk GapA (NADPH -avhengig). GapA/CP12- og GapA/CP12/PRK -komplekser ble oppnådd under de samme betingelsene som beskrevet i forklaringer til henholdsvis figur 3C og 3D. B, PRK -aktivitet ble analysert og uttrykt som en prosentandel av fullt redusert PRK. PRK -oksidasjon ble oppnådd ved 3 timers inkubasjon ved 25 ° C med 25 m m oksidert DTT. Det ternære komplekset med GapA og CP12 ble oppnådd som i figur 3D. C, GapA/CP12/PRK-komplekset ble rekonstituert og kromatografert som i figur 3D, ekvilibrert på nytt med 100 mm Tricine-NaOH, pH 7,9, i fravær av NAD, og ​​inkubert under forskjellige forhold (0,2 mm NAD 0,5 mm ribulose- 5-P 2 mm ATP 0,2 mm NADP 43 μ m BPGA 5 m m redusert DTT pluss 1 μg/ml tioredoksin). BPGA (43 μ m) ble produsert ved likevekt ved reaksjon av fosfoglyseratkinase med 3 m m 3-fosfoglyserat og 2 m m ATP (startkonsentrasjoner). Etter 1 times inkubasjon ved 4 ଌ med forskjellige effektorer, ble NADPH -aktiviteten til GapA analysert og uttrykt som prosent av aktiviteten til GapA før kompleks rekonstituering. En alikvot av den inkuberte prøven ble også lagt på en gelfiltreringskolonne for å kontrollere aggregeringstilstanden til proteinene. Stjernene indikerer de forholdene som ikke førte til kompleks dissosiasjon (NAD og ribulose-5-P se også fig. 5). D, samme betingelser som i C bortsett fra at PRK -aktivitet ble analysert og uttrykt som prosent av aktiviteten til det fullt reduserte enzymet. Ru5P, Ribulose-5-P.

Rekombinant CP12-2 ble uttrykt som et fusjonsprotein med en His-tagg ved N-enden av transittpeptidspaltningsstedet som forutsagt av ChloroP (Emanuelsson et al., 1999). Proteinet ble renset ved nikkelaffinitetskromatografi og merket fjernet ved proteolyse. Til tross for den beregnede molekylmassen på 8,5 kD migrerte renset CP12 i SDS-PAGE som et peptid på 20 kD etter inkubasjon med reduserte tioredoksiner og 16 kD etter inkubasjon med oksyderte tioredoksiner, noe som indikerer at disulfiddannelse førte til en stor konformasjonsendring som syntes å være beholdt selv under denaturerende forhold (fig. 2B).

In Vitro rekonstituering av binære og ternære komplekser

Evnen til isolerte GAPDH, CP12 og PRK til å binde til hverandre protein ble testet, og supramolekylære komplekser ble påvist ved gelfiltreringskromatografi. Ulike mulige konformasjoner av enkeltproteinkomponenter ble sammenlignet: Holo-GapA ble testet som enten NADP- eller NAD-kompleks, og CP12 og PRK ble testet som enten reduserte eller oksyderte proteiner. I det hele tatt kunne 12 mulige kombinasjoner av binære komplekser og åtte kombinasjoner av ternære komplekser tenkes, men bare noen få ble funnet å være produktive når det gjelder dannelse av supramolekylære komplekser.

Free GapA er en tetramer av identiske underenheter med en tilsynelatende masse på 120 kD i nærvær av enten NAD eller NADP (figur 3A). PRK er en dimer med en estimert masse på 110 kD under oksiderende forhold (fig. 3A), og tilsynelatende mindre (97 kD) når den reduseres (data ikke vist). Selv om toppene til GapA og PRK overlappet hverandre, var begge fullstendig atskilt fra 29 kD toppen av oksidert CP12 og 35 kD toppen av redusert CP12 (figur 3A). Siden CP12 er et iboende ustrukturert protein (Graciet et al., 2003a) mens gelfiltreringskolonnen ble kalibrert med kuleproteiner, kan disse bestemmelsene av CP12 -molekylmasse være sterkt overvurdert, noe som gjør polymerisasjonstilstanden til native CP12 usikker.

In vitro rekonstituering av binære (GapA/CP12) og ternære (GapA/CP12/PRK) komplekser. A, gelfiltrering (Superdex 200) av renset GapA, PRK (oksidert) og CP12 (enten oksidert eller redusert). Oksyderte og reduserte proteiner ble oppnådd ved 3 timers inkubering ved 25 ° C i nærvær av 25 m m redusert eller oksidert DTT. De fire prøvene ble lagt individuelt på kolonnen og kjørt under identiske forhold. Absorpsjonsmønstrene ved 280 nm ble normalisert og lagt over. Kolonneekvilibreringsbuffer var 50 m m Tris-HCl, pH 7,5, 150 m m KCl, 1 m m EDTA volum av ladede prøver var 0,2 ml og strømningshastighet var 0,5 ml min 𢄡. Kolonnekalibrering er rapportert nederst på figuren. Estimerte molekylmasser av prøver var 120 kD (GapA), 110 kD (PRK, oksidert), 35 kD (CP12, redusert) og 29 kD (CP12, oksidert). B, Samme type kromatografi som i A, bortsett fra at prøven lastet på kolonnen var en blanding av ekvimolær GapA og CP12 (oksidert) på underenhetsbasis, inkubert i 2 timer ved 4 ଌ i nærvær av 0,5 mm NADP før lasting . Kolonneekvilibreringsbuffer var som i A med tilsetning av 0,2 m m NADP. Sett inn, Western blots som viser at anti-GAPDH polyklonale antistoffer bare gjenkjenner GapA i toppen som tilsvarer 120 kD, og ​​anti-CP12 antistoffer gjenkjenner CP12 bare i lav Mr topp (29 kD). Stjerner angir kolonnefraksjonene (0,35 ml) som ble konsentrert og lagt på gelen for western blotting. C, Samme eksperimenter som i B bortsett fra at NAD erstattet NADP i både inkubasjons- og kolonnebuffere. GapA -toppen skiftet til venstre til en tilsynelatende molekylmasse på 150 kD. Elueringsmønsteret til B er lagt over for enkel sammenligning. Sett inn Western blots som viser at anti-CP12 antistoffer gjenkjente et 16 kD peptid som coeluterer med GapA tetramerer (36 kD i SDS-PAGE). D, samme eksperiment som i C bortsett fra tilsetning, i inkubasjonsbufferen, av ekvimolær PRK (oksidert) på underenhetsbasis. Sett inn, immunobloter som viser at toppen ved 640 kD inneholdt GapA, CP12 og PRK.

Inkubasjon av GapA med PRK ved ekvimolært forhold (underenhetsgrunnlag) klarte ikke å resultere i dannelse av et binært kompleks, uavhengig av typen pyridinnukleotid bundet til GapA eller redoks -tilstanden til PRK (data ikke vist). Ingen kompleks ble også oppdaget da GapA ble inkubert med NADP og oksidert CP12 (1: 1 subenhet -forhold). Begge proteinene eluerte som isolerte grupper og spesifikke antistoffer kunne ikke påvise noen CP12 som interagerer med GapA (figur 3B). Tvert imot, i nærvær av NAD i stedet for NADP, viste GapA -toppen en tilsynelatende økning i størrelse på 30 kD, mens toppen av gratis CP12 falt til lave nivåer (figur 3C). Immunoblotter bekreftet at under disse forholdene mesteparten av CP12 coeluterte med GapA, selv om inhibering av GapA -aktivitet var ubetydelig (fig. 4A). Å erstatte oksidert CP12 med redusert CP12 førte til at samspillet mellom de to proteinene ble avskaffet, selv i nærvær av NAD (data ikke vist).

PRK klarte ikke selv å binde CP12 under noen redoksbetingelser (data vises ikke). På den annen side dannet oksidert PRK kvantitativt et supramolekylært kompleks på ca. 640 kD når det ble inkubert med GapA-NAD og oksidert CP12 (fig. 3D). Immunobloter viste at alle tre partnerproteinene coeluterte i høyden Mr topp. Formation of the complex was prevented by reduction of PRK (data not shown). Interestingly, formation of the GapA/CP12/PRK complex led to dramatic inhibition of the activity of both enzymes. Within the complex, PRK was 12-fold less active than the free oxidized counterpart and 50-fold less active than the reduced enzyme ( Fig. 4B ). In a similar mood, the NADPH-dependent activity of GapA embedded in the complex was 5-fold lower than for free enzyme ( Fig. 4A ), whereas the NADH-activity remained unchanged.

In Vitro Dissociation of Binary and Ternary Complexes

The supramolecular GapA/CP12/PRK complex isolated in the presence of NAD proved to be quite stable. Buffer exchange to remove excess of NAD did not affect complex stability, and reloading of the complex on the column equilibrated without NAD led to negligible dissociation.

Ligands of either GapA or PRK were tested as possible effectors of complex dissociation. The PRK substrate ribulose-5-P had no significant effect on complex stability or enzyme activities ( Figs. 4 and ​ and5). 5 ). Incubations with NADP or ATP dissociated the complex, and a major peak of about 120 kD, including both GapA and PRK free proteins, was observed. The peak of free CP12 was hardly detectable under these conditions, partially due to the low molar extinction coefficient of this small protein ( Fig. 5 ). While dissociating the complex, ATP and NADP stimulated the activity of both GapA (NADPH dependent, 2-fold) and PRK (3- to 4-fold). However, the activity of both GapA and PRK released from the complex was much lower than the activity displayed by the enzymes before complex formation ( Fig. 4 ). Full recovery of GapA activity could be achieved by further incubation with the substrate 1,3-bisphosphoglycerate (BPGA produced by ATP, 3-phosphoglycerate, and phosphoglycerate kinase). The BPGA-producing mixture also dissociated the complex directly ( Fig. 5 ), thereby activating GapA (6-fold) at maximal levels. Complex dissociation by BPGA also resulted in PRK activation (7-fold) yet without reaching the activity of the oxidized free enzyme ( Fig. 4, B and D ). Reduced DTT and thioredoxins quantitatively dissociated the complex and fully activated PRK. GapA was activated only 2-fold by reducing conditions, similar to the effect of NADP or ATP. Independent of the effector used to destabilize the GapA/CP12/PRK complex, full activity of GapA was always recovered by further incubation with BPGA, while full PRK activity required DTT ( Fig. 4 ). In no case did dissociation of the ternary complex lead to binary complexes of whatsoever composition, as indicated by the elution volumes of released proteins. Complex dissociation invariably gave rise to GapA, CP12, and PRK free proteins ( Fig. 5 ).

Effect of GapA and PRK ligands on GapA/CP12/PRK complex stability. The GapA/CP12/PRK complex was reconstituted and chromatographed as in Figure 3D , re-equilibrated with 100 m m Tricine-NaOH, pH 7.9, in the absence of NAD, and incubated under different conditions (A, 0.2 m m NAD B, 0.5 m m ribulose-5-P C, 2 m m ATP D, 0.2 m m NADP E, 43 μ m BPGA F, 5 m m reduced DTT plus 1 μg/mL thioredoxin) before loading on the gel filtration column (Superdex 200). The column equilibration buffer included different effectors as reported in the figure. The elution volumes of GapA/CP12/PRK (640 kD), GapA and PRK (110� kD), and CP12 (29� kD) are indicated. Under conditions of complex disruption (ATP, NADP, BPGA, or reductants), the CP12 peak was hardly detectable, partly due to the lower molar extinction coefficient in comparison with either GapA or PRK (see “Materials and Methods”).


Introduksjon

Protein phosphorylation is the most common post-translational modification that regulates and/or fine tunes protein functions. Proteins are phosphorylated by protein kinases in a position-dependent manner, and they are reversibly dephosphorylated by protein phosphatases. In the chloroplast, numerous phosphorylation sites in photosynthesis-related proteins in the thylakoid membrane have been identified (Grieco et al. 2016). Recent studies have revealed that the reversible phosphorylation of the photosystem II (PSII) complex and light-harvesting complex of PSII (LHCII) is important to overcome light stress (Pesaresi et al. 2011 Tikkanen and Aro 2012 Allahverdiyeva et al. 2015). The phosphorylation of the LHCII trimeric complex, composed of Lhcb1, Lhcb2, and Lhcb3, drives state transition, which is an acclimation mechanism to balance excitation pressure between the PSII and photosystem I (PSI). Phosphorylated LHCII has been demonstrated to be relocated from the PSII to PSI under high-light conditions. Conversely, dephosphorylated LHCII is transported back to the PSII for balancing light absorption capacity between the PSII and PSI. I Arabidopsis, STN7 kinase is known to regulate the phosphorylation of LHCII (Bellafiore et al. 2005 Bonardi et al. 2005), whereas PP2C-type phosphatase (PPH1)/thylakoid-associated phosphatase of 38 kDa (TAP38) regulates the dephosphorylation of LHCII (Shapiguzov et al. 2010 Pribil et al. 2010). On the contrary, the phosphorylation of D1, one of the core subunits of the PSII complex (also called PsbA), appears to be involved in fine-tuning the photo-damaged D1 turnover in the PSII repair cycle (Baena-González and Aro 2002 Fristedt et al. 2009 Kato and Sakamoto 2009, 2018). STN8 kinase regulates the phosphorylation of D1, which is dephosphorylated by PSII core phosphatase (PBCP) (Bonardi et al. 2005 Samol et al. 2012). These phosphorylation states of protein complexes are expected to change the structural domains of the thylakoid membrane, grana core (appressed region), grana margin, end membrane, and stroma lamella (non-appressed region). For instance, phosphorylated LHCII migrates from the grana core, in which the PSII is mostly localized, to the grana margin and stroma lamella, in which the PSI is rich during state transition (Dumas et al. 2016). However, the phosphorylation state of most of the thylakoid membrane proteins, according to their spatial distribution within the thylakoid membrane, remains to be elucidated.

In this study, we attempted to exploit the Phos-tag technology, a relatively simple method to distinguish phosphorylated proteins from their non-phosphorylated isoforms, to characterize the phosphorylated proteins in the thylakoid membrane. Phos-tag, a dinuclear metal complex of the 1,3-bis[bis(pyridin-2-ylmethyl)amino]propan-2-olato dizinc (II) complex, is a phosphate-binding molecule, and it has been developed as a tool to visualize phosphoproteins (Kinoshita et al. 2004, 2005). The Phos-tag technology is utilized in various phophoprotein-trapping techniques, including SDS-PAGE. In Phos-tag SDS-PAGE, Phos-tag interferes with the migration of phosphorylated proteins in the gel, resulting in the separation of phosphorylated proteins as a retarded band from their non-phosphorylated forms, depending on the phosphorylation states. Indeed, this technology can separate phosphorylated proteins and non-phosphorylated proteins in the thylakoid membrane (Crepin and Caffarri 2015 Longoni et al. 2015). In this study, to the best of our knowledge, we first employed two-dimensional (2D) SDS-PAGE to separate the thylakoid membrane proteins (2D Phos-tag SDS-PAGE). Thylakoid proteins were separated in the first dimension by conventional SDS-PAGE and in the second dimension by Zn 2+ -Phos-tag SDS-PAGE phosphorylated proteins were detected as spots that showed retarded migration in the second dimension. Subsequently, protein spots that resulted from 2D Phos-tag SDS-PAGE were identified by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC–MS/MS). Furthermore, we extended the Phos-tag assay to examine the phosphorylation state of photosynthesis-related proteins in the structural domains of the thylakoid membrane, such as the grana stack, grana margin, and stroma lamella. The differences in the phosphorylation status of several photosynthesis-related proteins between the thylakoid subfractions, as determined by Phos-tag SDS-PAGE and immunoblotting, suggested the regulation of photosynthesis-related proteins by protein phosphorylation in the different structural domains.


Solutions at 1 mg/mL in buffer or culture medium are stable for approximately one month at 2-8 °C. Frozen aliquots can be stored up to 2 years. Repeated freeze/thaw cycles are not recommended. Solutions should be stored in silanized containers, since LPS can bind to plastics and certain types of glass (especially at concentrations of <0.1 mg/mL). If the LPS concentration is >1 mg/mL, adsorption to the sides of the vial is negligible. If glass containers are used, solutions should be vortexed for at least 30 minutes to redissolve the adsorbed product.

The product is soluble in water (5 mg/mL) or cell culture medium (1 mg/mL) yielding a hazy, faint yellow solution. A more concentrated, though still hazy, solution (20 mg/mL) has been achieved in aqueous saline after vortexing and warming to
70-80 °C. 21 Lipopolysaccharides are molecules that form micelles in every solvent. Hazy solutions are observed in water and phosphate buffered saline. Organic solvents do not give clearer solutions. Methanol yields a turbid suspension with floaters, while water yields a homogeneously hazy solution.

For cell culture use, LPS should be reconstituted by adding 1 mL of sterile balanced salt solution or cell culture medium to a
vial (1 mg) and swirling gently until the powder dissolves. Solutions can be further diluted to the desired working concentration with additional sterile balanced salt solutions or cell culture media.


Se videoen: Swim Bladder (August 2022).