Informasjon

Hvordan syntetisere og isolere enkeltstrenget cDNA fra en RNA -mal?

Hvordan syntetisere og isolere enkeltstrenget cDNA fra en RNA -mal?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Jeg vil gjerne ha rent enkeltstrenget cDNA etter eget valg. Jeg tenker på omvendt transkripsjon fra RNA (oppnådd ved in vitro-transkripsjon), nedbrytende RNA fra RNA-DNA-hybrid med RNase-H, oppvarming til 65C for å fjerne eventuelle oligoribonukleotider som fortsatt er bundet til DNA og passere løsningen gjennom G50 sephadex-kolonne bufret med eluering buffer. Dette er det jeg har i tankene, men er det noen effektive måter som er prøvd før? Eller har du noen forslag til denne protokollen?


Klart det vil fungere, eller gel rense ss cDNA, eller behandle rxn med alkali for å bryte ned RNA. De virkelige spørsmålene i tankene mine er:

  1. Hva vil du bruke som primer for RT?
  2. Hva skal du gjøre med dette rene ss cDNA?

Hvis du allerede har målet klonet (hvordan ellers ville du transkribere det in vitro?), hvorfor ikke bare gjøre en lineær PCR hvor du kutter plasmidet for å linearisere det på stedet du velger, og deretter kaste det i en PCR -maskin med bare en primer?

Hvorfor bry deg om å gå gjennom T7 RNA pol og RT trinnene (hvis du ikke trenger det)?


En forbedret metode for RNA -isolering fra loblolly furu (P. taeda L.) og andre nåletrær

Vev isolert fra nåletrær, spesielt de som tilhører Pinaceae -familien, for eksempel loblolly furu (Pinus taeda L.), inneholder høye konsentrasjoner av fenolforbindelser og polysakkarider som forstyrrer RNA -rensing. Isolering av RNA av høy kvalitet fra disse artene krever strenge prosedyrer for vevsamling i feltet og bruk av en RNA-isolasjonsprotokoll som består av flere organiske ekstraksjonstrinn for å isolere RNA av tilstrekkelig kvalitet for mikroarray og andre genomiske analyser. Isolasjonen av RNA av høy kvalitet fra feltinnsamlede loblolly furu-prøver kan være utfordrende, men flere modifikasjoner av standard vevs- og RNA-isolasjonsprosedyrer forbedrer resultatene sterkt. Omfanget av generell RNA-nedbrytning øker hvis prøver ikke blir korrekt innsamlet og transportert fra feltet, spesielt under store innhøstinger. Totalt RNA -utbytte kan økes betydelig ved å pulverisere prøver i en frysemølle med flytende nitrogen før RNA -isolering, spesielt når prøver kommer fra treaktige vev. Dette skyldes først og fremst tilstedeværelsen av oksidasjonsmidler, for eksempel fenolforbindelser, og polysakkarider som begge er tilstede på høye nivåer i ekstrakter fra de treaktige vevene til de fleste barskogarter. Hvis de ikke fjernes, kan disse forurensningene overføre og føre til problemer, for eksempel RNA -nedbrytning, som resulterer i lave utbytter og en RNA -prøve av dårlig kvalitet. Overføring av fenolforbindelser, så vel som polysakkarider, kan også redusere eller til og med eliminere aktiviteten til revers transkriptase eller andre polymeraser som vanligvis brukes for cDNA -syntese. Spesielt må RNA som skal brukes som mal for dobbeltstrenget cDNA-syntese i generasjonen av cDNA-biblioteker, enkeltstrenget cDNA-syntese for PCR eller qPCR, eller for syntese av mikroarray-målmaterialer, være av høyeste kvalitet hvis forskere forventer for å oppnå optimale resultater. RNA -isolasjonsteknikker som vanligvis brukes for mange andre plantearter, er ofte utilstrekkelige i deres evne til å fjerne disse forurensningene fra bartrærprøver og gir dermed ikke totale RNA -prøver egnet for nedstrøms manipulasjoner. I denne videoen demonstrerer vi metoder for feltsamling av nåletrærvev, som begynner med hogst av et førti år gammelt tre, til høsting av floem, sekundær xylem og reaksjons-xylem. Vi demonstrerer også en RNA-isolasjonsprotokoll som konsekvent har gitt RNA av høy kvalitet for påfølgende enzymatiske manipulasjoner.


Tilgangsalternativer

Få full journaltilgang i 1 år

Alle priser er NETTO -priser.
MVA blir lagt til senere i kassen.
Skatteberegningen vil bli fullført under kassen.

Få tidsbegrenset eller full artikkeltilgang på ReadCube.

Alle priser er NETTO -priser.


2. RNA -virusbiologi og omvendt genetisk smittsom klondesign

Nåværende RNA -virus omvendt genetiske systemer gjør bruk av flere vanlige trekk ved RNA -virusbiologi. For det første genererer RNA-virus genomiske kopier gjennom aktiviteten til en viral RNA-avhengig RNA-polymerase (RdRp). I tillegg er nesten alle RNA -virusreplikasjonsstrategier uavhengige av vertscellekjernen og ligger i stedet i cytoplasma. For RNA-virus med positiv streng, for eksempel poliovirus, umiddelbart etter inntreden og avdekking, blir genomisk RNA direkte oversatt av vertsribosomer for å generere virale proteinprodukter. Siden viruset sjelden trenger å pakke inn ekstra ikke-#x02011 strukturelle proteiner i virionen, fokuserer de fleste RNA-virusene med omvendt genetikk med positiv sans i stor grad på levering av enten transkribert genomisk RNA til cellecytoplasma eller levering av cDNA under kontroll av en viral transkripsjonspromotor slik som T7 eller CMV (figur 1) [3,4,5,6,7,8,9,10]. Imidlertid krever negative- og dobbeltstrengede RNA-virus revers-genetiske systemer ofte bruk av ytterligere hjelperkonstruksjoner for å introdusere RdRp og andre essensielle proteiner for å starte genomisk replikasjon. En nylig alternativ tilnærming, som har blitt brukt innen influensaforskning, er å syntetisere viralt RNA og drive mRNA -produksjon gjennom aktiviteten til vertspolymeraser som Pol I og Pol II [11,12]. Denne tilnærmingen har forenklet logistikken for plasmidtransfeksjon og økt effekten av rekombinant virusgjenoppretting. En lignende tilnærming har vært vellykket brukt for utvinning av et arenavirus, lymfocytisk choriomenigittvirus (LCMV) [13]. En ekstra plattform som har blitt brukt for generering av RNA -virus smittsom klon er det bakterielle kunstige kromosomet (BAC). BAC-konstruksjoner er enkelt-kopi-DNA-plasmider basert på F-plasmid av bakterier, som er genetisk stabile i E coli og tillate innsetting av store DNA -fragmenter å bli transkribert under kontroll av en transkripsjonell promotor som T7. BAC -konstruksjoner har vært brukt i mange år for utvinning av store DNA -virus. Imidlertid har den genetiske stabiliteten til disse konstruksjonene ført til bruk i rekombinante RNA -virusplattformer. Flere RNA-virus med positiv streng og ett RNA-virus med negativt tråd har brukt BAC som plattform for omvendt genetisk design (tabell 1). Siden de fleste RNA -virusreplikasjonsstrategier er adskilt fra vertsgenomet og replikasjonsmaskineriet, er det få RNA -virus som modifiserer vertsgenuttrykk og forårsaker onkogenese. Som et resultat trenger ikke RNA -omvendte genetiske systemer vanligvis å ta hensyn til den potensielle transformasjonen av vertsceller. Til slutt er de fleste RNA -virus begrenset til små genomstørrelser med flertallet mindre enn 15 kb på grunn av redusert genomisk stabilitet og redusert troskap til viral RdRp. Deretter bruker omvendte genetiske tilnærminger ofte bruk av cDNA genetiske kloner for større allsidighet i manipulering og modifikasjon av virusgenomet.

En oversikt over vanlige omvendt genetiske plattformer for gjenoppretting av positive og negative streng RNA-virus. De fleste positivstrengede RNA-virus revers genetiske plattformer består av enten direkte introduksjon av kopier i full lengde av virusgenomet (som er transkribert in vitro) eller introduksjon av enten et lineært eller plasmidassosiert (bakterielt kunstig kromosom, BAC) cDNA av genomet i full lengde i kombinasjon med et RdRp (for eksempel T7-polymerase). Negative-strand RNA-virus revers genetiske plattformer involverer ofte transfeksjon eller elektroporering av genomisk eller mer vanlig subgenomisk cDNA til permissive celler i kombinasjon med enten et hjelpervirus eller hjelperplasmider, som alle drives av et RdRp. Noen RNA-systemer med negativ streng bruker vertspolymerase I (Pol I) og II (Pol II) -promotorer for å drive viral RNA-syntese og mRNA-produksjon. I både positiv- og negativstreng-revers genetiske systemer uttrykkes RdRp (*) vanligvis konstitutivt eller forbigående i den tillatte celletypen.

Tabell 1

BAC-baserte plattformer for omvendt genetikk for gjenoppretting av rekombinante RNA-virus.

VirusFamilieGenomGenomstørrelseÅrHenvisning
Overførbart gastroenterittvirus (TGEV)Coronaviridae+ssRNA28 kb2000[4]
Japansk encefalittvirus (JEV)Flaviviridae+ssRNA11 kb2003[14]
Svineproduksjons- og respiratorisk syndromvirus (PRRSV)Arteriviridae+ssRNA15 kb2006[15]
Menneskelig koronavirus OC43Coronaviridae+ssRNA31 kb2006[16]
Alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus (SARS-CoV)Coronaviridae+ssRNA30 kb2007[17]
Dengue virus type 1Flaviviridae+ssRNA11 kb2007[18]
Bovint viralt diarévirus (BVDV)Flaviviridae+ssRNA12 kb2008[19]
Grensesykdomsvirus (BDV)Flaviviridae+ssRNA12 kb2010[20]
Klassisk svinepestvirus (CSFV)Flaviviridae+ssRNA12 kb2010[20]
Respiratorisk syncytialvirus (RSV)Paramyxoviridae-ssRNA15 kb2012[21]
Feline smittsom peritonittvirus (FIPV)Coronaviridae+ssRNA29 kb2012[22]
Midtøsten respiratorisk syndrom coronavirus (MERS-CoV)Coronaviridae+ssRNA30 kb2013[3]
Dengue virus type 2Flaviviridae+ssRNA11 kb2014[23]

Materialer og metoder

RNA -malkonstruksjon

For inokulering av protoplast ble RNA -maler oppnådd av in vitro transkripsjon med T7 RNA-polymerase ved bruk av pTCV66 (et cDNA i full lengde av TCV) og pT7C (+) (en cDNA-konstruksjon i full lengde av wt sat-RNA C og dets derivater) (Song og Simon, 1994). Δmot1 og rev/mot1 ble generert ved polymerasekjedereaksjon (PCR) ved bruk av primere T7C5 ′ og C3 ′ (Song og Simon, 1994) og enten pCAMdiAB eller pCMABr (Cascone et al., 1993) som DNA -maler. De resulterende PCR -produktene ble klonet inn i pUC19 ved SmaJeg nettsted. Construct 2xmot1 ble generert ved en tretrinns PCR-metode. Først ble et 3'-fragment oppnådd ved PCR ved bruk av primerne Mot1-Nco (5'-CATGCCATGGAAGAACCCAGACCCTCCAGCCAAAGGGTAAATGGGAAGAATGGTGGTTTTTAAAGGCGG-3 ') og C3' på T7C (+) mal, etterfulgt av behandling NcoI og gelrensing. For det andre ble et 5 'PCR-fragment oppnådd ved PCR ved bruk av primere oligo 13 (5'-AGAGCACTAGTTTTCCACCCT-3') og T7C5 ', etterfulgt av behandling med NcoI og gelrensing. 3'- og 5'-PCR-produktene ble ligert sammen, etterfulgt av PCR-amplifikasjon av cDNA i full lengde med endeprimere T7C5 'og C3'. Det resulterende PCR -produktet ble klonet inn SmaJeg kuttet pUC19. Construct Mot1-Nco ble generert som 2xmot1, bortsett fra at malen som ble brukt for 3 ′ PCR-fragmentet var Δmot1.

Konstruerer CX [beskrevet som CX-10 i Carpenter et al. (1995)] og CXM3+H4 (beskrevet som CX-9) ble generert ved PCR ved bruk av primere T7D5 'og oligo 8, og klonet inn i SmaI-fordøyd pUC19. CXM1 ble oppnådd ved en tretrinns PCR-basert metode. Først ble 5 ′ -delen av CX med det ekstra motivet1-hårnål generert med primere T7D5 ′ (Song og Simon, 1994) og CX10-1 (5′-TTTTGGGCCCATTTACCCTTGGCTGGAGGGTCTGGGATTCTTTCGAGTGGATATGC-3). For det andre ble 3'-delen av CX generert med primere CX10-2 (5'-AAATGGGCCCAAAAACGGTGGCAGCAC-3 ') og oligo 8 (Song og Simon, 1994) på ​​CX-malen. Både 3 ′ og 5 ′ PCR -fragmentene ble fordøyd med ApaI, gelrenset, ligert sammen og deretter brukt som maler for å amplifisere cDNA i full lengde med PCR ved bruk av endeprimerne (T7C5 'og oligo 8). CXM1 PCR-produktet i full lengde ble deretter ligert inn SmaJeg fordøyd pUC19. CXM3 ble oppnådd ved å erstatte NcoJEG-ApaI segment av CXM1 med PCR-produktet generert med primere CX10mot3 (5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCCCGGGGGTTTTTTTTCTTTTCTT-3 ′) og T7D5 ′ på CXM3+H4-malen (Snekker) et al., 1995), og behandlet med Ncojeg og ApaI. CXH4 ble oppnådd ved å erstatte NcoJEG-ApaI segment av CXM1 med PCR-produktet generert med primerne CXhairpin4 (5′-CAGTGGGCCCTAACACAGGTCAAAATAAAGCGACCTGGGGTTTTGTTTTCTTTCGAGTGGATACTGC-3 ′) og T7D5 ′ på CXM3 et al., 1995), og behandlet med Ncojeg og ApaI. CXM1+M3+H4 ble oppnådd ved å erstatte ApaJEG-SpeI segment av CXM1 med PCR-produktet generert med primere CX9mot1 (5′-CTGAGGGCCCGTGTAGTCTTCTCATC-3 ′) og oligo 8 på TCVSnaB I (Carpenter et al., 1995) og behandlet med Apajeg og SpeI. Alle konstruksjoner ble sekvensert for å verifisere tilstedeværelsen av riktige sekvenser.

For in vitro eksperimenter, ble RNA -maler oppnådd av in vitro transkripsjonsreaksjon med T7 RNA-polymerase ved bruk av enten PCR-amplifiserte DNA-maler eller renset og linearisert plasmid-DNA (Song og Simon, 1994 Nagy et al., 1997). Etter ekstraksjon med fenol-kloroform ble ikke-inkorporerte nukleotider fjernet ved gjentatt utfelling av ammoniumacetat-isopropanol (Song og Simon, 1994 Nagy et al., 1997). RNA-transkripsjonene i full lengde ble isolert fra 5% PAGE-ureageler. Etter etanolutfelling ble de oppnådde RNA-transkripsjonene oppløst i sterilt vann, og mengden og størrelsen ble målt med et UV-spektrofotometer og 5% polyakrylamid-8 M urea gel (denaturerende PAGE) analyse (Song og Simon, 1994 Nagy et al., 1997 ).

Konstruerer Control1+pr, mot1+pr, mot1forw+pr, mutmot1+pr, GC+pr, AU+pr og ministem+pr DNA ble generert av to sekvensielle PCR-runder ved hjelp av en av følgende maler: Control1-pr, mot1- pr, mot1forw-pr, mutmot1-pr, GC-pr, AU-pr og ministem-pr DNA (PDNagy og AESimon, manuskript under utarbeidelse). I første runde PCR ble den samme 3'-ende primeren C-prom (5'-GGGATAACTAAGGGTTTCATAGGGAGGCTATCTATTGG-3 ') og en av følgende 5' primere brukt: T7+SATC PROM, T7-MOT1+C, T7+MOT1+ SATC, T7+AU/GC+SATC, T7+GC+SATC, T7+AU+SATC og T7+MINITETRA+SATC. I den andre PCR-runden ble den samme 3'-endeprimeren C (d9) -prom (5'-AAGGGTTTCATAGGGAGGC-3 ') og en av følgende 5'-primere brukt: T7+SATC PROM, T7-MOT1+C, T7+MOT1+SATC, T7+AU/GC+SATC, T7+GC+SATC, T7+AU+SATC og T7+MINITETRA+SATC, henholdsvis på malene som ble oppnådd i første runde.

Konstruerer mot3+pr og mot3hairpin4+pr ble generert av to sekvensielle PCR-runder, først ved bruk av den samme 3 ′ ende primeren NEW/C-MOT3 (5′-GGGAGGCTATCTATTGGTTGTAGTCTTCTCATCTTAGTAG-3 ′) og enten T7Mot3/B (5T-TGT-TGT-GATT 3 ') eller CX10mot3 5' primere på CXM3+H4 DNA -mal. I den andre runden av PCR ble den samme 3'-ende primeren C (d9) -prom og enten T7Mot3/B eller CX10mot3 5 'primere brukt på malene som ble oppnådd i den første runden. CCA4+Mot1 og CCA4+Mot1short DNA ble generert av PCR ved bruk av den samme 3'-primeren CCA4 (5'-GGGTGGTGGTGGCCAGACCCTCCAGCC-3 ') og enten T7motif1 eller T7motif1-short (Nagy et al., 1998) primere på pT7C (+) mal.

Isolering av Arabidopsis protoplaster, inokulasjon og RNA gelblots

Protoplaster (5 × 106) fremstilt fra callus kulturer av Arabidopsis økotype Col-0 (Kong et al., 1997) ble inokulert med 2 μg av sat-RNA og enten 20 μg TCV genomiske RNA-transkripsjoner for replikasjonsstudier eller ingen TCV genomiske RNA-transkripsjoner for in vivo stabilitetsstudier. For å studere nedbrytningshastigheten til sat-RNA inne i kontra utenfor protoplastcellene, PEG-CaCl2 trinn ble utelatt under inokulering av protoplast for å hemme RNA -opptak av cellene i ett sett med eksperimenter. I et annet sett med eksperimenter ble protoplastene behandlet med 3,3 ug/ml RNase A for å ødelegge gjenværende sat-RNA utenfor cellene. Verken utelatelse av PEG-CaCl2 trinn eller RNase A-behandlingen påvirket nivået av overlevelse sat-RNA fra 2 til 44 h.p.i. sammenlignet med standardprøver (data ikke vist), som viser at overlevelses -RNA -ene var plassert inne i cellene.

Total RNA -ekstraksjon fra protoplaster, RNA -denaturering og gelblotting ble utført som beskrevet tidligere (Kong et al., 1997). Pluss tråder av sat-RNA ble påvist med et oligonukleotid C/D (5'-CTTGACTGATGACCCCTACG-3 ') merket ved bruk av polynukleotidkinase og [γ- 32 P] ATP. Den ribosomale RNA -sonden som ble brukt som lastekontroll (ikke vist) har blitt beskrevet tidligere (Simon et al., 1992). Minus tråder av sat-RNA ble oppdaget ved bruk av en [α-32 P] UTP-merket riboprobe hentet fra DraI-fordøyd pT7C (+) ved transkripsjon med T7 RNA-polymerase. For å fjerne overflødige mengder pluss-tråder av sat-RNA, ble de totale RNA-prøvene hentet fra protoplaster behandlet med RNase A etter glødning av pluss- og minusstrengene som beskrevet av Ishikawa et al. (1991). RNase-behandlingen økte ikke følsomheten til minus-streng-deteksjon for sat-RNA-ene sammenlignet med de ubehandlede prøvene (ikke vist).

TCV RdRp -analyse

Utarbeidelse av malavhengig RdRp fra TCV-infiserte kålrotplanter, in vitro transkripsjonsreaksjoner og produktanalyse ble utført som beskrevet tidligere (Song og Simon, 1994 Nagy et al., 1997, 1998) ved bruk av 20 ul RdRp -reaksjonsblandinger som inneholdt 3 μg mal -RNA. Etter ekstraksjon av fenol-kloroform og ammoniumacetat-isopropanolutfelling, ble produktene analysert på en 20 cm lang denaturerende 5% PAGE-8 M ureagel, etterfulgt av autoradiografi og densitometri (Nagy et al., 1997). RdRp -produktene ble behandlet med S1 -nuklease som beskrevet tidligere (Nagy et al., 1998). Dataene ble normalisert basert på antall mal-dirigerte radioaktive UTP innlemmet i RdRp-produktene og molarmengden av mal-RNA i RdRp-reaksjonen. For noen forsøk ble gelene farget med etidiumbromid, fotografert og tørket, etterfulgt av analyse med en fosfoimager som beskrevet (Nagy et al., 1997 ).


Begrensninger

I hvilken grad ikke-funksjonelle mRNA-spaltningsfragmenter påvirker knockdown-deteksjon er ganske variabel mellom forskjellige testede RNAi-linjer. Etter bare å ha testet seks RNAi -linjer, kan vi ikke forutsi hvor universelt dette fenomenet er, og mekanismene som forårsaker denne variasjonen er ikke klare.

Det er også viktig å vurdere begrensningene ved bruk av qPCR for å representere proteinnivåer, da mRNA -overflod ikke alltid korrelerer med proteinnivåer [10, 20, 21].

cDNA-syntese, et nødvendig trinn før du utfører qPCR, kan også resultere i potensiell skjevhet og ujevn representasjon av mRNA [22, 23]. I denne studien forsøkte vi å overvinne denne begrensningen ved å bruke Sensifast cDNA -syntesesettet, som blander tilfeldige heksamerprimere og forankret oligo dT (deoksytymin) for å resultere i upartisk 3 ′ og 5 ′ dekning og revers transkripsjon av alle genregioner.


RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization

Denne laboratorieguiden representerer en voksende samling av prøvde, testede og optimaliserte laboratorieprotokoller for isolering og karakterisering av eukaryotisk RNA, med mindre vekt på karakterisering av prokaryote transkripsjoner. Samlet fungerer kapitlene sammen for å pynte på RNA-historien. Hver av dem presenterer klare leksjoner med hjem, og inneholder rikelig flytskjemaer, tabeller og grafer for å lette læring og bistå i planleggings- og gjennomføringsfasen av et prosjekt.

RNA Methodologies, 3. utgave inneholder omtrent 30% nytt materiale, inkludert kapitler om nyere teknologi for RNA -interferens, inkludert: RNAi Microarrays Bioinformatics. Den inneholder også nye seksjoner om: nye og forbedrede RT-PCR-teknikker innovative 5 'og 3' RACE-teknikker subtraktive PCR-metoder metoder for å forbedre cDNA-syntese.

* Forfatteren er en anerkjent ekspert innen RNA-eksperimentering og grunnla Exon-Intron, et velkjent utdanningsverksted for bioteknologi
* Inkluderer klassiske og moderne teknikker
* Inkluderer flytdiagrammer, tabeller og grafer for å lette læring og bistå i planleggingsfaser av prosjekter


RESULTATER

Rensing av RdRP for mikrosekvensering

Vi har observert at RdRP-aktiviteten øker ikke bare i virusinfiserte planter, men også i viroidinfiserte tomater (Schiebel et al., 1993a). Fordi viroider ikke koder for proteiner, ble det imidlertid ikke påvist virale RNA-replikaser i viroidinfiserte planter. Følgelig skyldtes enhver RdRP-aktivitet som kan påvises i disse plantene utelukkende det vertskodede enzymet. Denne situasjonen muliggjorde isolering av T-RdRP. Dens aktivitet ble indusert opptil femdoblet, og for hvert rensingstrinn kunne den gjenopprettede aktiviteten tydelig tildeles tomatenzymet. Likevel, for å gi tilstrekkelige mengder protein for mikrosekvensering, måtte vi behandle 450 g viroidinfiserte apikale tomatblader, hovedsakelig som beskrevet av Schiebel et al. (1993a) (se Metoder). I vår forrige studie rapporterte vi at RdRP -fraksjoner som var eluert fra en DEAE - Sepharose -kolonne ble utsatt for affinitetskromatografi på dsDNA -cellulose (Schiebel et al., 1993a). I senere forsøk klarte vi imidlertid ikke å oppnå svært aktive enzympreparater da det ble brukt nylig fremstilte eller kommersielt tilgjengelige dsDNA -cellulosepreparater. Derfor ble dsDNA -cellulosekromatografien og det påfølgende MonoQ -rensingstrinnet erstattet med to runder med poly (U) -Sepharose -kromatografi. Etter disse trinnene,

20 enheter (50 pmol) delvis renset T-RdRP-protein ble samlet etter SDS-PAGE, 127-kD-proteinet ble brukt til mikrosekvensering (beskrevet i metoder).

Isolering og kloning av RdRP-spesifikke sekvenser

Endoproteolytisk fordøyelse av de geleksiderte 127 kD-proteinene resulterte i

50 omvendt fase HPLC-spesifikke topper. De fleste av disse inneholdt en blanding av flere proteinnedbrytningsprodukter. Likevel resulterte mikrosekvensering av peptider av T-RdRP i fire aminosyresekvenser som kunne brukes til å designe degenererte primere. Sekvensen til to av de fire peptidene og sekvensen til fire av de tilsvarende syntetiske oligonukleotider som var designet for polymerasekjedereaksjon (PCR) -eksperimenter er presentert i figur 1.

Design av RdRP-spesifikke PCR-primere.

Fire PCR -primere (RdRP8H1, RdRP8R1, RdRP15H1 og RdRP15R1) ble utledet fra aminosyresekvensene (AA) til to (130kD-8 og 130kD-15) av de fire peptidene som ble gjenvunnet etter mikrosekvensering av T-RdRP-enzymet. Grunnpar A (RdRP8H1/RdRP15R1) og primerpar B (RdRP15H1/RdRP8R1) ble brukt i PCR med tomat -cDNA.

Design av RdRP-spesifikke PCR-primere.

Fire PCR -primere (RdRP8H1, RdRP8R1, RdRP15H1 og RdRP15R1) ble utledet fra aminosyresekvensene (AA) til to (130kD-8 og 130kD-15) av de fire peptidene som ble gjenvunnet etter mikrosekvensering av T-RdRP-enzymet. Grunnpar A (RdRP8H1/RdRP15R1) og primerpar B (RdRP15H1/RdRP8R1) ble brukt i PCR med tomat -cDNA.

800 bp hadde blitt forsterket med primerpar B. Dette fragmentet (RdRP800) ble klonet inn i pT-PCR og sekvensert. Som vist i figur 2, den nøyaktige lengden på RdRP800 var 833 bp, omfattende en åpen leseramme (ORF) på 277 aminosyrerester.

To ZAP Express EcoRI cDNA -biblioteker ble screenet tre ganger med RdRP800 DNA -fragment (se Metoder) og 23 rekombinante plasmid -DNA som var påvist med den radioaktive sonden ble fjernet. Karakterisering av plasmidinnsatsene avslørte at ingen av dem tilsvarte mininumlengden på

3,0 kb, som forventes for et 127 kD protein. Det største hybridiserende EcoRI cDNA -fragmentet (RdRP24) var

2,3 kb og inneholdt hele 3 ′ delen av et RdRP-spesifikt cDNA.

For å få det manglende 5 ′ -området i RdRP cDNA, utførte vi rask forsterkning av 5 ′ cDNA -ender (5 ′ RACE) ved bruk av GSP400/AP1 -primerparet (se Metoder). Dette tillot forsterkning av et hovedprodukt av

1,9 kb. Datastøttet analyse av sekvensen som følge av overlappende RdRP5 ′ LØP og RdRP24-klonene avslørte (1) hele cDNA-sekvensen (figur 2A) (2) sekvensen til en ORF på 3.345 kb, som tilsvarer et forutsagt protein (C-RdRP) omfattende 1114 aminosyrer (figur 2B) og (3 ) en beregnet molekylmasse av C-RdRP på

127 kD, som er i god overensstemmelse med de eksperimentelle verdiene som var bestemt for T-RdRP ved bruk av SDS-PAGE (128 kD) og sukrose-gradient-sentrifugering (119 kD) (Schiebel et al., 1993a).

For å oppnå en nesten full lengde RdRP cDNA-klon, utførte vi PCR-forsterkning ved hjelp av primerparet P127BamI/P127Bgl (figur 2A). Ved å karakterisere PCR -produktene bestemte vi at alle de enkelte klonene inneholdt det forventede

3,6 kb RdRP-spesifikt fragment, men i hver sekvens var gjennomsnittlig åtte nukleotidsubstitusjoner detekterbare (data ikke vist). De fleste av disse EuroTaq -polymerasefeilene førte til aminosyreendringer. Derfor ble PCR gjentatt med Expand high-fidelity PCR-systemet under standardbetingelser (se Metoder). Selv om det ble funnet en gjennomsnittlig feil på to nukleotidsubstitusjoner i hvert av de 3,6 kb store fragmentene, ble en klon isolert som omfattet hele RdRP-spesifikke ORF uten aminosyreutveksling (figur 2B).

For å verifisere sekvensene til cDNA -klonene og PCR -produktene ble to genomiske biblioteker screenet med RdRP24 og RdRP5 ′ LØP fragmenter, henholdsvis. Mer enn 50 hybridiserende fager som dekker hele kodingsområdet for RdRP ORF ble isolert, og innsatsene til de utskårne plasmidene ble sekvensert. Ved flere sekvensjusteringer av eksonen, PCR-produktet og cDNA-sekvensene bekreftet vi at den opprinnelige RdRP-spesifikke cDNA-sekvensen er korrekt (figur 2).

De RdRP Gen er et enkeltkopi-gen i tomatgenomet

Restriksjonsstedene som er angitt på kartet i figur 3 har blitt utledet fra sekvensene av cDNA og genomiske kloner. Innenfor 9-kb-regionen til tomaten RdRP gen, ble det ikke funnet noe EcoRI -område. I kontrast har tre SacI -steder og to steder hver av BglII, XbaI og SphI blitt kartlagt. DNA -gel -blot -analyse av tomat -genomisk DNA som var kuttet av de fem enzymene ble utført for å bekrefte sekvenseringsdataene og for å bestemme kopiantallet til tomaten RdRP gen (figur 3).

Struktur av tomaten RdRP Gene og RdRP -proteinet.

(EN) Skjematisk fremstilling av tomatens fysiske struktur RdRP genet. Diagrammet representerer RdRP transkripsjon, med fire introner angitt med linjer vinklet inn i V -er. Start- (ATG) og termination (TGA) -kodonene er angitt. Plasseringene til RdRP15H1 og RdRP8R1 -primere (figur 1, primerpar B) er vist. En kontinuerlig cDNA -klon ble isolert etter PCR med tomat -cDNA ved å bruke P127BamI- og P127Bgl -primerne (se Metoder). Nukleotidsekvensen til C-RdRP cDNA har tiltredelsesnummeret Y10403 i EMBL- og GenBank-nukleotidsekvensdatabasene.

(B) Forutsagt aminosyresekvens av RdRP cDNA. De mikrosekvenserte peptidene er nummerert (1 til 4), og deres respektive aminosyresekvenser er trykt med fet skrift. Peptidsekvensene trykt med kursiv ble ikke brukt til primer -design. Det første RdRP-spesifikke PCR-produktet (RdRP800) som ble forsterket med primerpar B (se [EN]) er understreket. Stoppkoden er merket med en stjerne.

Struktur av tomaten RdRP Gene og RdRP -proteinet.

(EN) Skjematisk fremstilling av tomatens fysiske struktur RdRP genet. Diagrammet representerer RdRP transkripsjon, med fire introner angitt med linjer vinklet inn i V -er. Start- (ATG) og termination (TGA) -kodonene er angitt. Plasseringene til RdRP15H1 og RdRP8R1 -primere (figur 1, primerpar B) er vist. En kontinuerlig cDNA -klon ble isolert etter PCR med tomat -cDNA ved bruk av P127BamI- og P127Bgl -primerne (se Metoder). Nukleotidsekvensen til C-RdRP cDNA har tiltredelsesnummeret Y10403 i EMBL- og GenBank-nukleotidsekvensdatabasene.

(B) Forutsagt aminosyresekvens av RdRP cDNA. De mikrosekvenserte peptidene er nummerert (1 til 4), og deres respektive aminosyresekvenser er trykt med fet skrift. Peptidsekvensene trykt med kursiv ble ikke brukt til primer -design. Det første RdRP-spesifikke PCR-produktet (RdRP800) som ble forsterket med primerpar B (se [EN]) er understreket. Stoppkoden er merket med en stjerne.

1,3 kb ligger 65 bp oppstrøms AUG i den 5 ′ oversatte regionen. De to ytterligere fragmentene på 5,5 og 9 kb representerer 5 ′ og 3 ′ kantfragmentene av RdRP genet. Lengden på det mindre BglII -fragmentet (figur 3, bane 2) er identisk med lengden på 1,4 kb som ble bestemt ved sekvensanalyse. 5 ′ BglII-stedet ligger i det 480-bp lange intron 4, mens 3 ′ BglII-stedet ble funnet i den antatte RdRP genterminator. Det Xbal-begrensede DNA resulterte i tre hybridiserende fragmenter (figur 3, bane 4). 630-bp-fragmentet omfatter krysset mellom 5'-oversatt region og 2,4-kb intron 2. De to andre båndene representerer igjen henholdsvis 5'- og 3'-kantfragmentene.

I henhold til BglII-XbaI dobbel fordøyelse (figur 3, bane 3), kunne 7,5- og 2,4 kb XbaI-fragmentene (figur 3, bane 4) tilordnes henholdsvis 3 ′ og 5 ′ grenser. Som forventet fra sekvenseringsdataene, hele tomaten RdRP genet kan frigjøres av EcoRI (figur 3, bane 5). Fordi de to SphI -nettstedene som ligger i RdRP genet er atskilt med 11 bp, er bare to bånd synlige i EcoRI-SphI dobbel fordøyelse (figur 3, bane 6). Forskjeller i intensiteten til de hybridiserende fragmentene er basert på det faktum at α-32 P-dCTP-merket DNA-probe omfattet det RdRP-spesifikke cDNA, men ikke intronsekvensene. Således ga fragmenter som inneholdt store deler av intronene (se figur 3, kart) relativt svake signaler.

Identifikasjon av RdRP -homologer i forskjellige plantearter

HindIII-begrenset humant genomisk DNA og det fra potet, Arabidopsis, tobakk og de to tomatkultivarene Rentita og St. Pierre ble analysert ved DNA-gelblot-hybridisering ved bruk av en 1,7 kb 3'-spesifikk sonde (figur 4). Sammenlignet med de identiske båndmønstrene til de to tomat-DNA-ene, ble det funnet en HindIII-spesifikk restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme for sterkt hybridiserende potet-DNA og for tobakk-DNA. De knapt synlige signalene til tobakksfragmentene ble mer tydelige på en autoradiograf som ble avslørt i 72 timer (figur 4, lane Tobacco*), men i hverken det menneskelige eller Arabidopsis-DNA var et hybridiseringsfragment detekterbart på 72-timers eksponert autoradiograf (data ikke vist).

DNA Gel Blot -analyse av totalt genomisk tomat -DNA.

På det fysiske kartet over RdRP genet øverst, er de fire intronene angitt med svarte bokser. Start- (ATG) og termination (TGA) -kodonene er angitt. Posisjonene til steder som gjenkjennes av restriksjonsendonukleasene som brukes i gelbletten (nederst) er vist med vertikale stenger i skjematisk (midten). Lengden på hybridiserende DNA -fragmenter er presentert i kilobaser til venstre for gelen. DNA-gel-blot ble oppnådd med totalt genomisk tomat-DNA som ble hybridisert med hele α-32 P-dCTP-merkede RdRP-spesifikke cDNA og autoradiografert i 16 timer.

DNA Gel Blot -analyse av totalt genomisk tomat -DNA.

På det fysiske kartet over RdRP genet øverst, er de fire intronene angitt med svarte bokser. Start- (ATG) og termination (TGA) -kodonene er angitt. Posisjonene til steder som gjenkjennes av restriksjonsendonukleasene som brukes i gelbletten (nederst) er vist med vertikale stenger i skjematisk (midten). Lengden på hybridiserende DNA -fragmenter er presentert i kilobaser til venstre for gelen. DNA-gel-blot ble oppnådd med totalt genomisk tomat-DNA som ble hybridisert med hele α-32 P-dCTP-merkede RdRP-spesifikke cDNA og autoradiografert i 16 timer.

500 bp hybridisert tydelig med tomatspesifikk sonde. Karakterisering av dette klonede fragmentet (RdgTb500) og avslørte en nukleinsyresekvensidentitet på

91,6% med tomaten RdRP kodeområde (data ikke vist). For å bekrefte at mismatchene ikke skyldtes EuroTaq -polymerase eller sekvenseringsfeil, gjentok vi PCR -forsterkning, men tobakk cDNA ble brukt Fas en mal. Fremoverprimeren ble utledet fra RdgTb500 sekvens, og en p (dT)15 oligomer tjente som omvendt primer. Ved å analysere det klonede

950-bp PCR-produkt (RdcTb950), bekreftet vi RdgTb500 sekvens. Nukleinsyresekvensidentiteten mellom RdcTb950 og tomat-cDNA var 89,7% innenfor den 810 bp lange delen av kodingsområdet. I den 3 ′ oversatte regionen reduserte identiteten til 55,6% (data ikke vist). For proteinet ble en likhet på 96,7% og en identitet på 88,2% bestemt for de 270 aminosyrene.

Basert på disse resultatene ble to fremover og to revers primere som tilsvarer konserverte områder av tomaten og tobakk cDNA designet. Ved å bruke disse primerne forsterket vi et 540-bp intronfritt PCR-produkt (RdgPt500) fra genomisk DNA fra petunia. Sekvensanalyse avslørte 90,81% nukleinsyresekvensidentitet mellom RdgPt500 og tomat-cDNA og 90,63% identitet mellom petuniaspesifikt DNA og RdcTb950. For proteinet ble likhet på 99,45% og identitet på 87,3% bestemt mellom petunia og tomatsekvensene, mens likhet på 98,34% og identitet på 88,96% ble beregnet for de 181 aminosyrene til petunia- og tobakksklonene.

DNA Gel Blot -analyse av totalt genomisk DNA fra forskjellige plantearter og mennesker.

DNA-gel-blot ble oppnådd med HindIII-begrensede totale genomiske DNA fra de angitte organismer som ble hybridisert med en 1,7 kb α-32 P-dCTP-merket 3'-spesifikk RdRP cDNA-probe og autoradiografert i 16 timer. Filteret ble eksponert på nytt i 72 timer for å øke signalstyrken til de tobakkspesifikke fragmentene (lane Tobacco*). På den overeksponerte autoradiografen var ingen hybridiserende fragmenter synlige i humane og Arabidopsis -baner. Dermed ble bare Tobacco* -feltet inkludert. λ-PstI, fag-lambda-DNA begrenset med PstI.

DNA Gel Blot -analyse av totalt genomisk DNA fra forskjellige plantearter og mennesker.

DNA-gel-blot ble oppnådd med HindIII-begrensede totale genomiske DNA fra de angitte organismer som ble hybridisert med en 1,7 kb α-32 P-dCTP-merket 3'-spesifikk RdRP cDNA-probe og autoradiografert i 16 timer. Filteret ble eksponert på nytt i 72 timer for å øke signalstyrken til de tobakkspesifikke fragmentene (lane Tobacco*). På den overeksponerte autoradiografen var ingen hybridiserende fragmenter synlige i humane og Arabidopsis -baner. Dermed var bare Tobacco* -feltet inkludert. λ-PstI, fag-lambda-DNA begrenset med PstI.

88% for petunia- og tobakksekvensene (se også ovenfor). Identiteten mellom tomaten og Arabidopsis samt mellom tomat- og hvetekodingssekvensene er

70%. Denne graden av sekvensdivergens vil forklare mangelen på å oppdage Arabidopsis RdRP genet på DNA gel blot (figur 4) med tomatspesifikk sonde.

Forening av T-RdRP-aktivitet med cDNA-kodet 127-kD-protein

For å vise direkte at C-RdRP og T-RdRP er identiske, introduserte vi RdRP cDNA-konstruksjoner i Escherichia coli å uttrykke et funksjonelt enzym. Dessverre viste det seg at E coli–Syntetisert C-RdRP ble avsatt som et uoppløselig og inaktivt protein i bakterielle inkluderingslegemer (data ikke vist). Refolding av den denaturerte C-RdRP klarte heller ikke å gjenopprette enzymaktivitet.

Delvis sammenligning av C-RdRP-aminosyresekvensen med tobakk, Petunia, Arabidopsis og hvete.

Formodede RdRP-sekvenser fra andre plantearter ble forsterket ved PCR ved bruk av forskjellige kombinasjoner av RdRP-spesifikke primere (se teksten). De utledede aminosyresekvensene fra tobakk (Tb.), Petunia (Pt.), Arabidopsis (Ara.) Og hvete (Wh.) RdRP-spesifikke PCR-produkter ble justert med den forutsagte tomaten (Tom.) RdRP-aminosyresekvensen. Identiske aminosyrerester er svart. Sekvensjusteringen er gitt fra posisjonene 805 til 897, i henhold til C-RdRP-aminosyresekvensen.

Delvis sammenligning av C-RdRP-aminosyresekvensen med tobakk, Petunia, Arabidopsis og hvete.

Formodede RdRP-sekvenser fra andre plantearter ble forsterket ved PCR ved bruk av forskjellige kombinasjoner av RdRP-spesifikke primere (se teksten). De utledede aminosyresekvensene fra tobakk (Tb.), Petunia (Pt.), Arabidopsis (Ara.) Og hvete (Wh.) RdRP-spesifikke PCR-produkter ble justert med den forutsagte tomaten (Tom.) RdRP-aminosyresekvensen. Identiske aminosyrerester er svart. Sekvensjusteringen er gitt fra posisjonene 805 til 897, i henhold til C-RdRP-aminosyresekvensen.

For å demonstrere identiteten til T-RdRP med C-RdRP, undersøkte vi om T-RdRP-aktivitet konsekvent var assosiert med C-RdRP-proteinet analysert med antisera til C-RdRP-peptider (se metoder) under de fem rensingstrinnene . Som kildemateriale brukte vi de 30 000g pellet av et homogenat som ble ekstrahert fra 220 g viroid-infiserte apikale tomatblader. Pelleten, som bare inneholdt den mindre delen av total T-RdRP, ble brukt fordi den viste seg å være mindre forurenset av terminale nukleotidyltransferase (r) (TNTase [s]) enn 30.000g supernatant. TNTase -aktivitet forvrenger RdRP -aktivitetsverdier som bestemmes av standardanalysen (Schiebel et al., 1993a).

Den relative berikelsen av T-RdRP-protein og sammenhengen mellom økende spesifikk RdRP-aktivitet og graden av renhet under rensing er dokumentert i figur 6.Den solubiliserte pelleten (figur 6A, bane 1) ble påført ved bruk av Q-Sepharose Fast Flow-kromatografi (figur 6A, bane 2), som ble fulgt av et Q-Sepharose-høyytelsesrensingstrinn (figur 6A, bane 3). Disse to anionbytterkromatografitrinnene fjernet flertallet av protein, inkludert TNTase (r). Den mest effektive økningen i spesifikk aktivitet ble oppnådd av polynukleotidaffinitetsmediet poly (A) - og poly (U) –Sepharose. T-RdRP-fraksjonene fra disse to kolonnene inneholdt lave mengder andre proteiner (figur 6A, felt 4 og 5). Det reneste enzymet kunne elueres fra en hydroksyapatittkolonne, med bare et enkelt bånd synlig på den sølvfargede gelen (figur 6A, bane 6). Imidlertid ble hydroksyapatittkromatografi ikke utført for storstilt fremstilling av aktivt T-RdRP. Av ukjente årsaker gjenvunnet vi bare omtrent halvparten av enzymaktiviteten som ble påført denne kolonnen.

Identiteten til T-RdRP med C-RdRP ble demonstrert av en immunoblot (figur 6B) som var sammenlignbar med den sølvfargede gelen. Bare ett protein av

127 kD var påviselig av det C-RdRP-spesifikke antistoff AP431 (se Metoder). I tillegg økte intensiteten til immunresponsen med hensyn til økningen i den spesifikke RdRP -aktiviteten (figur 6B). Ytterligere signaler på protein gel blot (figur 6B, spor 1 til 3) som tilsvarer proteiner av

Henholdsvis 80 og 50 kD var også påviselig med preimmun serum (data ikke vist), noe som pekte på forurensning av AP431 immunserum med ikke-C-RdRP-spesifikke antistoffer. Enzymaktiviteten til hydroksyapatitteluatene var lavere enn forventet fra signalstyrken til den sølvfargede gelen og proteingelbletten. Eluatet i den sjette banen (figur 6A og 6B) presenteres imidlertid for å vise preparatets homogenitet.

SDS-PAGE-analyse av renseprosedyren for T-RdRP fra 30.000g Pellet av et bladhomogenat.

(EN) Sølvfarget proteinmønster av RdRP-preparater.

(B) Protein gel blot tilsvarende (EN) og visualisering av T-RdRP av det C-RdRP-spesifikke antistoff AP431.

Posisjonene til molekylære massemarkører er angitt i kilodalton til venstre. Den spesifikke RdRP -aktiviteten som ble bestemt for hver fraksjon er gitt i enheter (U) per milliliter. Volumet av prøver lastet på gelene var 1 μL per kjørefelt. Bane 1, kombinerte ekstrakter fra 30 000g pellets (Ex) bane 2, Q-Sepharose Fast Flow eluat (FF) bane 3, Q-Sepharose høyytelseseluat (HP) bane 4, poly (A) –Sepharose eluat (PA) bane 5, poly (U)- Sepharose eluat (PU) og bane 6, hydroksyapatitt eluat (HA). Pilene til høyre angir 127-kD-båndet til RdRP, og de til venstre angir posisjonene til molekylvektmarkører i kD. Eksperimentelle detaljer er gitt i Metoder.

SDS-PAGE-analyse av renseprosedyren for T-RdRP fra 30.000g Pellet av et bladhomogenat.

(EN) Sølvfarget proteinmønster av RdRP-preparater.

(B) Protein gel blot tilsvarende (EN) og visualisering av T-RdRP av det C-RdRP-spesifikke antistoff AP431.

Posisjonene til molekylære massemarkører er angitt i kilodalton til venstre. Den spesifikke RdRP -aktiviteten som ble bestemt for hver fraksjon er gitt i enheter (U) per milliliter. Volumet av prøver lastet på gelene var 1 μL per kjørefelt. Bane 1, kombinerte ekstrakter fra 30 000g pellets (Ex) bane 2, Q-Sepharose Fast Flow eluat (FF) bane 3, Q-Sepharose høyytelseseluat (HP) bane 4, poly (A) –Sepharose eluat (PA) bane 5, poly (U)- Sepharose eluat (PU) og bane 6, hydroksyapatitt eluat (HA). Pilene til høyre angir 127-kD-båndet til RdRP, og de til venstre angir posisjonene til molekylvektmarkører i kD. Eksperimentelle detaljer er gitt i Metoder.

Til slutt er assosiasjonen mellom C-RdRP og RdRP-aktiviteten dokumentert av den unormale gelfiltreringsatferden til T-RdRP på Superdex 200 som er illustrert i figur 8. Et eluat fra hydroksyapatittkromatografien ble supplert med kanin IgG (150 kD) og BSA (66 kD). Proteinblandingen ble kromatografert og en sammenligning av UV280 verdier med RdRP-aktivitetsprofilen til de eluerte fraksjonene fikk oss til å tro at T-RdRP er mindre enn BSA-proteinet. I henhold til størrelse var det forventet at T-RdRP ble eluert veldig snart etter IgG-markørproteinet og tydelig før et 66-kD-protein. Elueringsvolumer på 1,35 ml for IgG, 1,50 ml for BSA og 1,58 ml for T-RdRP ble imidlertid bestemt (figur 8). Etter SDS -gelanalyse av UV280-absorberende materiale fant vi at det fremtredende proteinet i den RdRP -aktivitetsholdige fraksjonen var 127 kD (data ikke vist). Identiteten til dette 127 kD-proteinet med C-RdRP ble demonstrert med A.P431 (Figur 8, innfelt gel).

Induksjon av T-RdRP-aktivitet ved viroid infeksjon er korrelert med et økt steady state-nivå av RdRP mRNA

Ved RNA-virus og viroid infeksjon øker plantekodede RdRP både i aktivitet og mengde (Astier-Manifacier og Cornuet, 1971 Duda et al., 1973 Takanami og Fraenkel-Conrat, 1982 van der Meer et al., 1984 Schiebel et al. ., 1993a). RNA gel blot-analyse ble utført med totalt RNA isolert fra potetspindelknollviroid (PSTVd)-infiserte og viroidfrie tomatplanter. Hybridisering med en α- 32 P-dCTP-merket RdRP-spesifikk DNA-probe avslørte en tre til femdobling av mengden av steady state RdRP mRNA i de to PSTVd-infiserte tomatkultivarene Rutgers og Basket Pak (figur 9 jf. Bane 1 og 3 med bane 2 og 4). Den økte RdRP-aktiviteten på omtrent tre ganger, som tidligere ble rapportert for systemisk PSTVd-infiserte tomatblader (Schiebel et al., 1993a), er helt i samsvar med resultatene oppnådd ved RNA gel blot-analysen. Dette indikerer at i viroidinfiserte tomatplanter skyldes RdRP-induksjon en forbedring av transkripsjon og/eller mRNA-stabilitet.

RdRP -aktivitet faller sammen med et AP341-Detekterbart tomatspesifikt 127-kD protein i Eluater fra Poly (U) –Sepharose og fra Hydroxyapatite.

(EN) Protein gel blot analyse av Poly (U) –Sepharose eluerer med C-RdRP-spesifikt antistoff AP431. Fargeintensiteten til 127-kD-båndet korrelerer sterkt med aktiviteten til RdRP. Prøver var fra 100 μL fraksjoner av poly (U) –Sepharose kromatografeluater (se figur 6). U, enheter.

(B) Protein gel blot analyse som vist i (EN), men prøver var fra hydroksyapatitteluatfraksjonene (se figur 6).

RdRP -aktivitet faller sammen med et AP341-Detekterbart tomatspesifikt 127-kD protein i Eluater fra Poly (U) –Sepharose og fra Hydroxyapatite.

(EN) Protein gel blot analyse av Poly (U) –Sepharose eluerer med C-RdRP-spesifikt antistoff AP431. Fargeintensiteten til 127-kD-båndet korrelerer sterkt med aktiviteten til RdRP. Prøver var fra 100 μL fraksjoner av poly (U) –Sepharose kromatografeluater (se figur 6). U, enheter.

(B) Protein gel blot analyse som vist i (EN), men prøver var fra hydroksyapatitteluatfraksjonene (se figur 6).

Forsinket koeluering av T-RdRP fra en Superdex 200-kolonne.

Eluat fra hydroksyapatittkromatografien som representerer

0,75 enheter T-RdRP i 15 μL 0,16 M NaPi i buffer F ble supplert med 2 μg hver av kanin-IgG (Sigma) og BSA (Serva 11924) og lastet på en forhåndskalibrert Superdex 200-kolonne i Smart-systemet. Kolonnen ble ekvilibrert ved 5 ° C med en buffer på 0,15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 og 1,5 mM DT T. Elueringsvolumer var 1,35 ml for IgG, 1,505 ml for BSA og 1,58 ml for RdRP. Fraksjoner som inneholdt enzymaktivitet ble utsatt for protein gel blot-analyse med det C-RdRP-spesifikke antistoff AP431. Immunobloten viser et enkelt bånd på 127 kD og maksimal flekkintensitet i fraksjon 17. Verken RdRP-aktivitet eller et 127 kD-protein var påviselig i fraksjon 13, der et standardprotein av denne størrelsen skulle elueres. AU, absorbans enheter U, enheter.

Forsinket koelusjon av T-RdRP fra en Superdex 200-kolonne.

Eluat fra hydroksyapatittkromatografien som representerer

0,75 enheter T-RdRP i 15 μL 0,16 M NaPi i buffer F ble supplert med 2 μg hver av kanin-IgG (Sigma) og BSA (Serva 11924) og lastet på en forhåndskalibrert Superdex 200-kolonne i Smart-systemet. Kolonnen ble ekvilibrert ved 5 ° C med en buffer på 0,15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 og 1,5 mM DT T. Elueringsvolumer var 1,35 ml for IgG, 1,505 ml for BSA og 1,58 ml for RdRP. Fraksjoner som inneholdt enzymaktivitet ble utsatt for protein gel blot-analyse med det C-RdRP-spesifikke antistoff AP431. Immunobloten viser et enkelt bånd på 127 kD og maksimal flekkintensitet i fraksjon 17. Verken RdRP-aktivitet eller et 127 kD-protein var påviselig i fraksjon 13, der et standardprotein av denne størrelsen skulle elueres. AU, absorbans enheter U, enheter.

In vitro-analyse av T-RdRP

Hvis plantespesifikke RdRP er nøkkelenzymer i post-transkripsjonelle gendempningsprosesser, bør de være i stand til å syntetisere cRNAer av

50 til 130 nukleotider fra RNA -maler. For å undersøke T-RdRP-syntetiserte produkter in vitro, modifiserte vi RdRP-aktivitetsstandardanalysen (se Metoder). Totalt tomat -RNA ble brukt som mal, og produktene ble analysert ved bruk av PAGE.

RNA -fragmenter av & gt100 nukleotider ble produsert da analysen ble utført med 1 ug mal RNA (figur 10, bane 2). En nedgang i malen (0,1 μg) resulterte også i en nedgang i produktene. På den annen side hadde økte mengder totalt RNA (5 μg) liten effekt på produktmengde og kvalitet (figur 10, spor 1 til 3). Evnen til T-RdRP til også å bruke DNA som mal syntes å være veldig lav. Standardanalysen ble utført med totalt genomisk tomat -DNA så vel som med linearisert plasmid -DNA, men bare noen få produkter var påviselige etter PAGE (figur 10, spor 5 til 7). For å demonstrere at produktene besto av nysyntetisert RNA og ikke skyldtes en T-RdRP-spesifikk terminal transferase-aktivitet (Schiebel et al., 1993b), ble nukleotidtrifosfatene utelatt i en reaksjon. Fordi ingen produkter var synlige, kan det konkluderes med at T-RdRP ikke er i stand til å starte tilsetningen av minst α-32 P-UTP (se metoder) til malen RNA (figur 10, bane 8). Identiteten til RNA som det T-RdRP-syntetiserte produktet ble videre undersøkt ved å behandle reaksjonsblandingen med RNase A før PAGE (figur 10, bane 9). I tillegg ble det vist at malen er ødelagt av RNase A, men ikke av DNase-behandling (data ikke vist), noe som indikerer at RNA er det virkelige substratet til T-RdRP.


Isolering av bukspyttkjertel -RNA

Måling av genuttrykk innebærer vanligvis isolering av totalt RNA som inkluderer mRNA. Isolering av intakt RNA av høy kvalitet fra bukspyttkjertelen kan være en utfordring på grunn av de svært høye nivåene av RNase. Denne protokollen beskriver modifikasjoner av den mye brukte guandiniumtiocyanat-fenol-kloroform ekstraksjonsmetoden, ved bruk av kommersielle preparater av ekstraksjonsreagens. Den største modifikasjonen av eksisterende protokoller er å øke forholdet mellom ekstraksjonsreagens og vevsvekt. Denne prosedyren gir total RNA av høy kvalitet egnet for nedstrøms måling av genuttrykk, for eksempel kvantitativ RT-PCR og mikroarray-transkriptomanalyse.

Stikkord: Bukspyttkjertel, mRNA, TRIZOL.

Måling av genuttrykk har blitt en vesentlig tilnærming i de fleste fysiologiske studier. Nøkkelen til å oppnå pålitelige resultater for genuttrykk er isolering av høy kvalitet, intakt totalt RNA. Total RNA kan deretter brukes i en rekke teknikker for å måle genuttrykk. Isolering av RNA fra bukspyttkjertelen kan være en utfordring fordi bukspyttkjertelen er en av de rikeste kildene til RNase, et av fordøyelsesenzymer som produseres av den eksokrine bukspyttkjertelen.

På grunn av brukervennligheten og resultatene av høy kvalitet, er sannsynligvis den mest brukte teknikken for å isolere RNA guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform ekstraksjonsmetode for Chomczynski og Sacchi (1). Bruk av disse reagensene har blitt kommersialisert og blandinger av guanidiniumtiocyanat og fenol selges, for eksempel som TRIZOL. Da vi brukte TRIZOL i laboratoriet mitt for å isolere RNA fra musen i bukspyttkjertelen, etter protokollen gitt av leverandøren, var resultatene ikke optimale, som bedømt ved analyse av det totale RNA ved gelelektroforese. Vi undersøkte endringer i standardprotokollen og oppnådde en modifisert protokoll som fremdeles er enkel å bruke og på en pålitelig måte gir total RNA av høy kvalitet fra gnagere i bukspyttkjertelen. Endringene var å bruke et høyere forhold mellom TRIZOL og vevsvekt og å utføre flere trinn ved 4 o C enn i leverandørens protokoll. Vi fant at prøver homogenisert i TRIZOL kan lagres på ubestemt tid ved -70 o C før videre behandling, noe som gjør at mange prøver kan høstes på relativt kort tid. Vi har vellykket brukt totalt RNA isolert med denne protokollen for måling av pankreasgenuttrykk ved kvantitativ RT-PCR (6), Northern blot (2) og Affymetrix mikroarrayanalyse (5). Protokollen var også vellykket i å isolere total RNA av høy kvalitet fra mus med caerulein-indusert pankreatitt, hvor vevet gjennomgår skader som inkluderer upassende fordøyelsesenzymaktivering (6). I tillegg ble protokollen lett vedtatt av en kollega (3) som erstattet den svært arbeidskrevende teknikken han hadde brukt tidligere som innebar mange trinn over en periode på 2 dager (4).

1. Materialer

1.1. Kjemikalier (merknad 1)

1. Guanidiniumtiocyanat-fenoloppløsning. Dette kan kjøpes fra flere kilder, inkludert TRIZOL (www.lifetchnologies.com) eller Tri-Reagent (www.sigmaaldrich.com).

2. Dietylpyrocarbonate- (DEPC) behandlet vann. For å vanne i en RNase-fri glassflaske, tilsett DEPC til 0,01% (volum/volum). La stå over natten, autoklav og la avkjøle før bruk.

5. 75% etanol (i DEPC-behandlet vann)

6. Reagenser for agarosegelelektroforese

1.2 Engangs forbruksvarer

2. Rør for homogenisering som gjør at homogenisatorsonden kan nå bunnen av røret. Vi bruker Falcon #352017, rundbunnet, 14 ml polystyrenrør eller Falcon #352097, 15 ml koniske bunnkulturrør med hetter.

3. Filtrerte pipettespisser for 20 μL, 200 μL, 1000 μL pipetter

5. Filtrer papir (f.eks. Whatman klasse 2, #1002070)

1.3 Utstyr

1. Pipetter (20 μL, 200 μL, 1000 μL)

2. Høyhastighets bladhomogenisator, for eksempel en Polytron

5. En eksikator festet til en vannvakuumkilde

6. Spektrofotometer eller annet instrument som er i stand til å måle absorbansen av små volumer ved UV -bølgelengder (f.eks. Nanodrop eller Agilent Bioanalyzer)

8. Gelelektroforeseapparat og UV -lysboks med kamera. Programvare for bildeanalyse for å kvantifisere intensiteten til 28S og 18S ribosomale RNA -bånd.

8. En benkeplate med en avlesning på 0,01 g

9. Valgfritt: Turbomix virvelvedlegg (#SI-0564, www.scientificindustries.com) som gjør det praktisk å behandle opptil 12 TRIZOL-homogenater om gangen

10. Valgfritt: En svingende bøtte mikrosentrifuge

2.1 Forberedelse av materialer (merknad 2, 3)

1. Forkjøl homogeniseringsproben i et rør med DEPC-vann på is

2. Alikvot TRIZOL i homogeniseringsrør på is. Bruk 2 ml TRIZOL for 40 mg eller mindre bukspyttkjertelvev (

20% eller mindre av en voksen mus i bukspyttkjertelen). (Merknad 4)

3. Merk mikrofugerør og legg på is

4. Gjør klar en benkeplate med et tørt stykke filterpapir eller annet absorberende papir

2.2 Høsting av vev

1. Drep musen (bruk CO2 etterfulgt av rask halshugging eller annen IACUC-godkjent metode).

2. Klipp huden nær bunnen av magen uten å stikke hull i bukveggmuskelen, og skrell huden opp mot nakken Skjær gjennom magemusklen og bindevevet for å åpne magen, og sprut inni med iskald PBS. Pass på å unngå å introdusere pelshår.

3. Fjern så raskt som mulig en liten del av bukspyttkjertelen (& lt20% av orgelet) og legg den i iskald PBS på is. Raskt: Overfør bukspyttkjertelvevet til filterpapiret på balansen, tarere balansen og overfør det viskede vevet tilbake til den iskald PBS. Registrer endringen i masseverdi fra balansen som tilsvarer vevet vevet vev. Det bør være> 40 mg når du bruker 2 ml TRIZOL. Hvis ikke, kutt vevet mindre eller øk volumet av TRIZOL i homogeniseringsrøret for å opprettholde et forhold på ≤20 mg vev per ml TRIZOL. Legg deretter vevet i den kjølte TRIZOL. En annen arbeider kan samle resten av bukspyttkjertelen for histologiske og/eller proteinanalyser. (Notater 5, 6)

4. I en avtrekkshette, homogeniser umiddelbart i 30 sekunder på is ved bruk av en Polytron eller tilsvarende homogenisator ved full hastighet. (Fjern overflødig vann fra sonden først.)

5. Alikvoter homogenatet i merkede mikrofugerør, opptil 1 ml per rør ved hjelp av en pipette.

6. Oppbevar umiddelbart ved -70 o C til den er klar til behandling.

7. Hvis du forbereder flere prøver, skyll homogenisatorsonden mellom prøvene ved å kjøre noen sekunder i DEPC-behandlet vann, tre ganger, og rist eller fjern overflødig vann fra sonden. Alternativt skyll sonde i rent TRIZOL -reagens.

2.3. Behandler TRIZOL -homogenatene

1. Gjør klar 2 sett med merkede mikrofugerør (merk 3 sett med mikrofugerør hvis TRIZOL -homogenatene ikke ble lagret i mikrofugerør, for eksempel hvis hele bukspyttkjertelen ble homogenisert i et større volum og lagret i homogeniseringsrøret)

2. Tine prøver på is Vortex for å blande. Hvis TRIZOL -homogenatene ikke allerede er i mikrofugerør, overfør 1 ml til merkede mikrofugerør.

3. Sentrifuger ved 12 000 x g x 10 minutter ved 4 o C.

4. Dekanter supernatanten i et nytt rør, pelleten er hard og vil ikke fjerne kastet.

5. Tilsett 200 μL kloroform til hvert rør. Bland godt, 15 sekunder på en virvel ved lavt mellomområde.

6. Inkuber 2 minutter ved romtemperatur.

7. Sentrifuger ved 12 000 x g x 15 min ved 4 o C. Hvis en svingende bøtte -mikrosentrifuge er tilgjengelig, sentrifuger prøvene i ytterligere 30 sekunder som flater ut interfasen og gjør det lettere å skille i neste trinn, dette kan være ved romtemperatur.

8. Overfør den øvre vandige fasen til ferske merkede rør. Unngå å forstyrre grensesnittet som skiller RNA i den klare øvre fasen fra proteiner (inkludert RNase!) I den nedre (rødfargede) organiske fasen. Kast den nedre kloroformfasen i farlig avfall. Behandle brukte TRIZOL på samme måte som farlig avfall.

9. Tilsett 0,5 ml isopropanol til hvert rør som inneholder den øvre fasen. Vend om flere ganger og virvel for å blande.

10. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter.

11. Sentrifuger ved 10 000 x g x 10 minutter ved 4 o C.

12. Kast supernatanten ved nøye dekantering i en beholder for farlig avfall. Tørk av overflødig væske med et rent vev. Pelleten kan være løs, så vær forsiktig mens du dekanterer og blotter røret.

1. 3.Tilsett 150 μL 75% etanol til pelleten og pipetter opp og ned for å resuspendere RNA.

14. Tilsett 1 ml mer 75% etanol og virvel.

15. Sentrifuger ved 7.500 x g x 5 min ved 4 o C.

16. Kast supernatanten ved å dekantere. Tørk av overflødig væske med et rent vev. Pelleten vil være liten og hvit, i det nederste hjørnet av mikrofugerøret.

17. Tørk prøvene under vakuum i noen minutter. Dette kan gjøres ved hjelp av en ekssikkator festet til en vannvakuumkilde. Den tørkede pelleten vil være veldig liten og gjennomsiktig eller klar, og kan være vanskelig å se. Over-tørking kan gjøre det vanskelig å oppløse pelleten.

18. Tilsett 100 μL nukleasefritt vann. Sveip røret for å oppløse RNA.

19. Oppbevar umiddelbart ved -70 o C til bruk.

2.4. Vurdering av kvaliteten på det totale RNA

1. Kvantifiser RNA -utbyttet ved spektrofotometri.

Fortynn en liten alikvot (1 μL) av RNA-prøven 50-100 ganger i TE-buffer (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) og legg den i en kvartsmikrokuvett (nødvendig for å passere UV-bølgelengder) i spektrofotometeret. Mål OD260 (nukleinsyrer) og OD280 (protein). 1 OD260 = 40 ug/ml RNA. Ved å bruke denne protokollen, fra 20% av en voksen mus bukspyttkjertel [RNA] = 1-2 μg/μL (100-200 μg totalt).

2. Vurdering av renheten til RNA ved spektrofotometri. Beregn OD260 / OD280 forholdet som skal være 1,6 - 1,8. Rent RNA uten proteinkontaminering har et forhold på 2,0.

3. Vurdering av intaktiteten til RNA ved gelelektroforese. Denne prosedyren isolerer totalt RNA som for det meste er ribosomalt RNA. De viktigste RNA -artene i ribosomalt RNA er 28S- og 18S -båndene, som består av

Henholdsvis 5000 baser og 1900 baser. Derfor, hvis RNA er intakt, bør intensiteten til 28S/18S RNA -båndene på en gel være & gt2. Hvis RNA degraderes vil forholdet være & lt2 fordi 28S RNA lettere nedbrytes enn 16S RNA.

en. Hell en 1,2% agarosegel med formaldehydbuffer

b. Forbered prøvene i denaturerende buffer i mikrofugerør:

ii. 2,8 ul 5x løpebuffer

c. Varm prøvene til 65 ° C i 15 ', avkjøl på is.

d. Tilsett 1,4 ul lasting buffer til hver, bland, sentrifuger kort og legg på gelen.

e. Elektroforiser gelen ved 75V x

f. Skyll gelen 3 x 10 minutter med dH2O for å fjerne formaldehyd som forstyrrer flekker.

g. Flekk gelen 10 minutter med etidiumbromid eller SYBR Green II, skyll i dH2O, og sett av gelen ved hjelp av et instrument som en ChemiDoc eller Bio Gel Doc (fra Bio-Rad, www.bio-rad.com), eller en ImageQuant LAS 4000 (fra GE Life Sciences, www.gelifesciences.com). (Merknad 7)

4. Eksempel på total RNA av høy kvalitet fra bukspyttkjertelen [fra referanse (6)], som bedømt av 28S/18S -forholdet på & gt2 er vist i Figur 1. Fem μg totalt RNA ble lastet per kjørefelt og elektroforet, gelen ble farget med SYBR Green II og avbildet med et Bio-Rad ChemiDoc XRS digitalt system. Tidspunktene som er angitt refererer til tiden som har gått etter den første caerulein -injeksjonen. WT: villtype mus CF: Cftr-/- mus.


Figur 1. Agarose gelelektroforese av bukspyttkjertel -RNA farget med SYBR Green II.

2.5. Tilpasning av metode til isolert acini

1. Denne protokollen kan også brukes til å forberede RNA fra isolert bukspyttkjertel acini. I dette tilfellet suspenderes acini i iskald PBS og pelleteres forsiktig (sentrifugert ved

200 x g x 30 sek) i et mikrofugerør. Supernatanten aspireres forsiktig av pelleten. Deretter tilsettes iskald TRIZOL til pelleten og homogeniseres umiddelbart på is. Forutsatt en pellet i rimelig størrelse (& lt100 μL pakket volum), vil 1 ml TRIZOL være tilstrekkelig. En sonikator av sonde-type fungerer bra i dette tilfellet fordi det er lite bindevev i isolerte acini sammenlignet med det intakte bukspyttkjertelvevet, og en liten sonde med spiss passer lett inn i et mikrofugerør.

2. For kvantitativ RT-PCR, 1 μL av en 1000X fortynnet prøve (

1 ng totalt RNA) er tilstrekkelig for de fleste mRNA. Laboratoriet mitt bruker vanligvis et RT-PCR-sett med ett rør (QuantiTect® SYBR® Green RT-PCR www.qiagen.com) som bruker PCR minus strandprimer glødet til mRNA av interesse som mal for RT-trinnet i reaksjonen . Selvfølgelig kan cDNA fremstilles fra en større mengde av det tilberedte totale RNA som deretter brukes til PCR.

Merknad 1: Alle reagenser må ha molekylærbiologisk kvalitet og skal oppbevares kun for RNA -arbeid, atskilt fra annen bruk. Det samme gjelder pipettespisser og rør. Bruk av kulturelle, sterile materialer som holdes adskilt for RNA -bruk minimerer potensialet for RNase -forurensning.

Notat 2: Protokollen bruker en kommersiell løsning av guanidiniumtiocyanat-fenol, for eksempel TRIZOL® fra www.lifetchnologies.com eller Tri-Reagent® fra www.sigmaaldrich.com. "Tri" i navnene er et akronym for "Total RNA Isolation" og for det faktum at det er mulig å isolere tre forskjellige deler fra homogenatene: RNA, protein og DNA (1).

Merknad 3: Bruk hansker under hele prosedyren: fenol er veldig etsende og hansker forhindrer forurensning av prøver med RNase på huden din.

Merknad 4: Mengden TRIZOL til bukspyttkjertelvev er avgjørende ettersom guanidiniumet i TRIZOL må denaturere og inaktivere den høye mengden RNase i bukspyttkjertelen. Bruk 1 ml TRIZOL per 20 mg våtvekt av bukspyttkjertelen, dvs.

5X volumet anbefalt av leverandøren. En voksen mus bukspyttkjertel er

200 mg. Vi behandler vanligvis bare

1/5 av en voksen mus i bukspyttkjertelen med 2 ml TRIZOL.

Merknad 5: Som et alternativ til rundbunnede homogeniseringsrør kan 15 ml koniske bunnrør brukes så lenge homogenisatorsonden når langt nok, slik at et 2 ml volum blir tilstrekkelig homogenisert. Et dyrkningsrør har den fordelen at prøven ikke trenger å deles i alikvoter etter TRIZOL -homogenisering, og at hele homogenatet kan lagres i et enkelt tak med rør i fryseren til behandling. Dette er nyttig hvis hele bukspyttkjertelen skal behandles for å isolere RNA som vil kreve

10 ml TRIZOL for en mus i bukspyttkjertelen.

Merknad 6: Noen laboratorier fryser bukspyttkjertelen i flytende nitrogen (LN2) etterfulgt av lagring enten i LN2 eller ved -70 o C inntil behandling for å isolere RNA (7). Den frosne prøven males deretter i en morter og støter med LN2 etterfulgt av behandling. Selv om denne teknikken gir gode resultater, er det tungvint å male vevet i LN2 og overfør deretter den frosne, pulveriserte bukspyttkjertelen til ekstraksjonsreagenset. Fordi TRIZOL -homogenater i bukspyttkjertelen kan lagres ved -70 o C inntil behandling for å isolere RNA, er den like egnet som hurtigfrysing i LN2 for behandling av et stort antall prøver på kort tid.

Merknad 7: Det må utvises forsiktighet ved bruk og avhending av etidiumbromid fordi det er kreftfremkallende. Mindre er kjent om sikkerheten til SYBR Green II, men siden det er et nukleinsyrebindende fargestoff, bør det utvises forsiktighet.


Merknader om cDNA -bibliotek | DNA -biblioteker

I denne artikkelen vil vi diskutere om cDNA-bibliotek:- 1. Betydningen av cDNA Library 2. Prinsipp for cDNA -bibliotek 3. Vektorer som brukes i konstruksjonen 4. Fremgangsmåte i konstruksjonen 5. Fordeler 6. Ulemper 7. Søknader.

Betydningen av cDNA Library:

Et cDNA -bibliotek er definert som en samling av cDNA -fragmenter, som hver har blitt klonet inn i et separat vektormolekyl.

Prinsipp for cDNA -bibliotek:

Når det gjelder cDNA -biblioteker, produserer vi DNA -kopier av RNA -sekvensene (vanligvis mRNA) av en organisme og kloner dem. Det kalles et cDNA -bibliotek fordi alt DNA i dette biblioteket er komplementært til mRNA og produseres ved omvendt transkripsjon av sistnevnte.

Mye av eukaryot DNA består av repeterende sekvenser som ikke transkriberes til mRNA, og sekvensene blir ikke repre -sentert i et cDNA -bibliotek. Det må bemerkes at prokaryoter og lavere eukaryoter ikke oppdager introner, og forberedelse av cDNA er generelt unødvendig for disse organismer. Derfor produseres cDNA -biblioteker bare fra høyere eukaryoter.

Vektorer som brukes i konstruksjonen av cDNA -biblioteket:

Både bakterie- og bakteriofag -DNA brukes som vektorer i konstruksjonen av cDNA -bibliotek.

Tabellen nedenfor gir en detaljert innhold og sjenert informasjon:

Prosedyre for konstruksjon av cDNA -bibliotek:

Trinnene involvert i konstruksjonen av et cDNA -bibliotek er som følger:

1. Ekstraksjon av mRNA fra den eukaryote cellen:

For det første blir mRNA oppnådd og renset fra resten av RNA -ene. Det finnes flere metoder for rensing av RNA, for eksempel trizolekstraksjon og shytion og rensing av kolonner. Kolonne puri & shyfication utføres ved å bruke oligomere dT-nukle- og shyotidbelagte harpikser der bare mRNA som har og skårer poly-A-halen vil binde seg.

Resten av RNA -ene elueres ut. MRNA elueres ved å bruke elueringsbuffer og litt varme for å sepa og shyrere mRNA-strengene fra oligo-dT.

2. Konstruksjon av cDNA fra Ex & shytracted mRNA (figur 6.4):

Det er forskjellige strategier for konstruksjon og shytion av et cDNA. Disse diskuteres som følger:

Prinsippet for denne metoden er at en komplementær DNA -streng syntetiseres ved hjelp av reverse tran & shyscriptase for å lage et RNA: DNA -dupleks. RNA -strengen blir deretter nicket og erstattet av DNA. I denne metoden er det første trinnet å annealere en kjemisk syntetisert oligo-dT-primer til 3 ′ polyA-halen til RNA.

Primeren er vanligvis 10-15 resi og shydues lang, og den primerer (ved å gi en gratis 3 ′ ende) syntesen av den første DNA-strengen i nærvær av revers trans & shycriptase og deoksyribonukleotider. Dette etterlater et RNA: DNA -dupleks.

Det neste trinnet er å erstatte RNA -strengen med en DNA -streng. Dette gjøres ved å bruke RNase H -enzym som fjerner RNA fra RNA: DNA -dupleks. DNA -strengen som blir etterlatt blir deretter betraktet som malen, og den andre DNA -tråden syntetiseres ved virkningen av DNA poly & shymerase II.

(b) Self-Priming-metoden:

Dette innebar bruk av en oligo-dT primer-gløding ved polyadenylathale av mRNA for å prime første DNA-strandsyntese mot mRNA. Dette således dannede cDNA har en tendens til midlertidig å brette seg tilbake på seg selv og danne en hårnålssløyfe. Dette resulterer i selvpriming av den andre strengen.

Etter syntesen av den andre DNA-strengen, må denne sløyfen spaltes med en enkeltstrengsspesifikk nuklease, f.eks.SI-nuklease, for å tillate innsetting i klon- og sky-vektoren. Denne metoden har en alvorlig ulempe. Spaltningen med SI -nuklease resulterer i tap av en viss mengde sekvens ved 5 ′ enden av klonen.

(c) Land et al. Strategi:

Etter syntese av første streng, som er primet med en oligo-dT-primer som vanlig, blir cDNA halet med en streng med cytidinrester ved bruk av en & shyzyme terminal transferase. Denne kunstige oligo-dC-halen brukes deretter som et glødingssted for en syntetisk oligo-dG-primer, slik at syntese av den andre strengen kan skimtes.

(d) Homopolymer Tailing:

Denne tilnærmingen bruker enzymet terminal transferase, som kan polymerisere nukleotider på 3 ′-hydroksyl av både DNA og RNA mol & shyecules. Vi utfører syntesen av den første DNA -strengen i hovedsak som før, for å produsere en RNA: DNA -hybrid.

Vi bruker deretter terminal transferase og et enkelt deoksyribonukleotid for å legge haler av det nukleotidet til 3 ′ ender av både RNA og DNA -tråder. Resultatet av dette er at DNA -strengen nå har en kjent sekvens ved sin 3 ′ ende. Vanligvis brukes dCTP eller dATP.

En komplementær oligomer (syntetisert kjemisk) kan nå glødes og brukes som en primer for å lede andre strengs syn & shythesis. Denne oligomeren (og også den som ble brukt til syntese av første streng) kan i tillegg inkludere et restriksjonssted for å hjelpe til med å klone det resulterende dobbeltstrengede cDNA.

(e) Rask forsterkning av cDNA -ender (RACE):

Noen ganger er det slik at vi ønsker å klone et bestemt cDNA som vi allerede har noen sekvensdata for, men med særlig vekt på integriteten til 5 ′ eller 3 ′ endene. RACE -teknikker (Rapid Amplification of cDNA Ends) er tilgjengelig for dette. RACE -metodene er delt inn i 3 ’RACE og 5 ’RACE, i henhold til hvilken ende av cDNA vi er i og er interessert i.

I denne typen RACE utføres revers transkriptasesyntese av en første DNA-streng ved bruk av en modifisert oligo-dT-primer. Denne primeren består av en strekning med unik adapter se & shyquence etterfulgt av en oligo-dT-strekk. Den første streng syntesen etterfølges av en andre streng syntese ved bruk av en primer som er intern i den kodende sekvensen av interesse.

Dette etterfølges av PCR ved hjelp av

(i) Den samme interne primeren og ‘

(ii) adapter-sekvensen (dvs. utelatelse av oligo-dT). Selv om det i teorien burde være mulig å bruke en enkel oligo-dT-primer gjennom i stedet for adapter-oligo-dT og adapterkombi og -syngering, kan den lave smeltetemperaturen for en oligo-dT-primer forstyrre de påfølgende PCR-rundene.

I denne typen RACE syntetiseres første cDNA-streng med revers transkriptase og en primer fra den kodende sekvensen. Unincor & shyporated primer fjernes og cDNA-strengene hales med oligo-dA. En andre cDNA-streng blir deretter syntetisert og shysisert med en adapter-oligo-dT-primer.

De resulterende dobbeltstrengede mol & shyecules blir deretter utsatt for PCR ved bruk

(i) En primer nestet i kodeområdet og

(ii) Adapter -sekvensen. En nestet primer brukes i den endelige PCR for å forbedre spesifisiteten. Adap & shytor-sekvensen brukes i PCR på grunn av den lave smeltetemperaturen til en enkel oligo-dT primer, som i 3 ’RACE ovenfor. En rekke sett for RACE er kommersielt tilgjengelige.

RNaseH- og homopolymer-tailing-metodene genererer til slutt en kol og shylection av dobbeltstrengede, stump-endede cDNA-molekyler. De må nå befinne seg og være knyttet til vektormolekylene. Dette kan gjøres ved stump-endet ligering, eller ved tilsetning av koblinger, fordøyelse med det relievende enzymet og ligering til vektor.

(b) Innlemmelse av begrensningsområder:

Det er mulig å tilpasse homopolymer -tailing -metoden ved å bruke primere som er modifisert for å inkorporere restriksjoner. I dia & shygrammet som vises på neste side, er oligo-dT-primeren modifisert for å inneholde et restriksjonssted (i figuren, et seilsted GTCGAC).

3 ′ enden av den nylig syntetiserte første cDNA -strengen er halet med C ’s. En oligo-dG-primer, igjen foran et seilsted innenfor et kort dobbeltstrenget område av oligonukleotidet, blir deretter brukt for sekvensering og utover-streng-syntese.

Vær oppmerksom på at denne metoden krever bruk av et oligonukleo og shytid som inneholder en dobbeltstrenget region. Slike oligonukleotider lages ved å syntetisere og skyse de to strengene hver for seg og deretter tillate dem å gløde for hverandre.

(c) Homopolymer Tailing av cDNA:

Et annet alternativ er å bruke terminal transferase igjen. Behandling av den stump-endede dobbeltstrengede cDNA med terminal transferase og dCTP fører til poly & shymerisering av flere C-rester (typisk 20 eller så) til 3 ′-hydroksylet i hver ende.

Behandling av vektoren med terminal transferase og dGTP fører til at flere G -rester blir uklar og skypet på endene av vektoren. (Alternativt kan dATP og dTTP brukes.) Vektoren og cDNA kan nå gløde, og baseparret region er ofte så omfattende at behandling med DNA-ligase er unødvendig.

Faktisk kan det være hull i stedet for nicks ved vektorinnsatsgrensene, men disse blir omformet av fysiologiske prosesser når de rekombinante molekylene har blitt introet og shyducert til en vert.

Fordeler med cDNA -bibliotek:

Et cDNA -bibliotek har to ekstra fordeler. For det første er den beriket med fragmenter fra ak og transkribert gener. For det andre avbryter introner ikke de klonede sekvensene introner vil utgjøre et problem når målet er å pro og skygge et eukaryotisk protein i bakterier, fordi de fleste bakterier ikke har mulighet til å fjerne intronene.

Ulemper med cDNA Library:

Ulempen med et cDNA -bibliotek er at det bare inneholder sekvenser som er tilstede i modent mRNA. Introner og andre se & shyquences som endres etter transkripsjon er ikke tilstedeværende sekvenser, for eksempel promotorer og enhancers, som ikke er transkribert til RNA, er heller ikke tilstede i et cDNA -bibliotek.

Det er også viktig å merke seg at cDNA -biblioteket bare representerer de gensekvensene som er ekspressert og trykket i vevet som RNA ble isolert fra. Videre avhenger frekvensen av en par & shytikulær DNA -sekvens i et cDNA -bibliotek av overflod av det tilsvarende mRNA i det gitte vevet. I kontrast er nesten alle gener tilstede med samme frekvens i et genomisk DNA -bibliotek.

Applikasjoner av cDNA Library:

Følgende er applikasjonene til cDNA -bibliotek og skyer:

1. Oppdagelse av nye gener.

2. Kloning av cDNA-molekyler i full lengde for in vitro-studie av genfunksjon.

3. Studie av repertoaret til mRNA ekspressert og trykket i forskjellige celler eller vev.

4. Studie av alternativ spleising i forskjellige og sjenerte celler eller vev.


Se videoen: Hvordan isolere yttervegg med Rockwool stålstenderplate (August 2022).