Informasjon

Proteinisolasjon fra pattedyrceller

Proteinisolasjon fra pattedyrceller



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Hvilken ikke-SDS-buffer kan jeg bruke for å isolere protein fra pattedyrceller? Proteinet er beregnet på testing av elektrontransportkjedekomplekser.


Kort svar - du må bruke et ikke -ionisk vaskemiddel. Disse vil oppløse lipidmembraner, men etterlate de fleste proteinkomplekser intakte og mange proteiner i aktiv form.

Imidlertid er det mange av disse tilgjengelige, og å finne den rette for en bestemt jobb er en svart kunst.

Den vanlige tilnærmingen er å starte med noe som er mye brukt og ikke for dyrt som Triton X-100. Vaskemidler med glykosidhodegrupper er også mye brukt, men har en tendens til å være dyre.


Engineering Fundamentals of Biotechnology

2.32.5 Heterolog proteinuttrykk i pattedyrcellekultur

Pattedyrceller er for tiden den valgfrie verten for ekspresjon av heterologe eukaryote proteiner som er komplekse, som krever riktig folding eller multimerisk samling, eller som krever ‘autentiske’ menneskelignende PTM-er, for eksempel riktig glykosylering. På grunn av dette produseres omtrent 60–70% av alle rekombinante legemidler i pattedyrceller. Den mest brukte pattedyrscellen er den udødeliggjorte kinesiske hamster -ovariecellen (CHO), men en rekke andre linjer er godkjent for produksjon av biofarmasøytiske proteiner, inkludert babyhamster -nyre (BHK), human embryo -nyre (HEK), musmyelom (NS0) ) og humane netthinneceller (se referanser 16 og 17).

Den vanligste tilnærmingen for å generere stabilt transformerte CHO -cellelinjer er å starte med en verts -CHO -stamme som er mangelfull i begge dhfr alleler, et gen som koder for dihydrofolatreduktase (DHFR). Disse DHFR-minus CHO-cellene krever tilsetning av glycin, hypoksantin og tymidin (GHT) i mediet for vekst. Det heterologe genet og dhfr genet blir deretter klonet i en enkelt eller i separate pattedyrsuttrykkvektorer (se gjennomgang av Yin et al. [2] for en nylig liste over kommersielt tilgjengelige vektorer) og transfektert til vertslinjen. Plasseringen og det integrerte plasmidkopienummeret varierer blant de transfekterte cellene, som er valgt på et GHT-minus medium. Som et resultat vil veksthastigheten og uttrykket for det heterologe proteinet variere på grunn av posisjonelle og kopitallseffekter, så generelt blir hundrevis av uavhengige transfekterte cellelinjer screenet for å identifisere de mest lovende kandidatene for utvikling av bioprosesser og oppskalering. En annen valgbar markør som brukes er glutaminsyntetase (gs) -gen, med seleksjon på et medium uten glutamin. Høyere uttrykkslinjer er valgt for å tilsette kjemikalier som blokkerer enzymatisk aktivitet av markørenzymet (metotreksat tilsettes for DHFR -systemet og metioninsulfoksimin legges til for GS -systemet), siden overlevende celler sannsynligvis vil ha høyere ekspresjonsnivåer av selekterbare markørgener og antagelig nabo -genet som koder for produktet av interesse.

En ekstra fordel med pattedyrceller er evnen til å utskille komplekse, multimere og riktig brettede proteinprodukter, for eksempel antistoffer. Pattedyrs cellekulturer dyrkes rutinemessig i store bioreaktorer i rustfritt stål som suspensjonskulturer, vanligvis i utvidede batchkulturer med medium tilsatt enten halvkontinuerlig eller i små partier, og heterologe proteiner skilles ut i kulturbuljongen, noe som letter utvinning og nedstrøms behandling . Siden pattedyrceller er i stand til å forplante pattedyrvirus, er viral clearance et vesentlig trinn i bioterapeutisk produksjon, sammen med fjerning av vertscelle -DNA på grunn av potensiell forurensning av onkogent DNA. I løpet av de siste 20 årene har det vært betydelige forbedringer i produktiviteten til heterologe proteiner ved bruk av cellekultur fra pattedyr. Det anslås at produkttitere har steget mer enn 100 ganger, fra ∼50 mg l −1 på midten av 1980-tallet til dagens nivåer på opptil 3-5 g l −1 [17]. På samme måte har den spesifikke produktiviteten økt omtrent 25 ganger fra 0,006 til 0,15 g l-dagers -1. Disse forbedringene tilskrives først og fremst forbedrede mediumformuleringer, driftsstrategier for bioprosesser og prosesskontroll.

Selv om det er gjort betydelige fremskritt i CHO -cellens produktivitet, er det minst tre store utfordringer: (1) nedgang i heterolog proteinproduksjon over lange tidsrammer/flere passasjer, (2) redusert produktivitet ved høy celletetthet, og (3) lange tidsrammer som kreves for å gå fra gen til produkt. Stabiliteten i rekombinant proteinproduksjon er en viktig egenskap for en produksjonslinje, selv for en batchkulturprosess som starter med celler fra en fungerende cellebank, siden det kreves flere passasjer i frøgjærertoget før produksjonsgjæreren inokuleres. Redusert produktivitet kan skyldes gendemping (den spesifikke nedbrytningen av produkt -mRNA) eller vertscellemodifikasjoner av transgenet. For eksempel i CHO-DG44 rekombinante cellelinjer hadde bare 15–20% av de transfekterte linjene et stabilt nivå av proteinproduksjon utover 6 måneder. Et av målene under den omfattende screeningsprosessen er således å identifisere celler med stabile produksjonsegenskaper samt høy veksthastighet og høy produktivitet. Strategier som har blitt brukt for å minimere gendemping inkluderer å velge en passende promoter og målrette transgenet mot spesifikke områder i kromosomet, inkludert DNA -elementer som stillaser/matrisefesteområder i konstruksjonen, antirepressorelementer eller allestedsnærværende kromatinåpningselementer [16] .

En annen utfordring med cellekultur hos pattedyr er den lange prosessutviklingstiden som kreves. Prosessene med genoverføring, screening og bioreaktorprosessutvikling for pattedyrscellekultur tar minimum 12 måneder [17]. Nylig har forbigående genuttrykk i pattedyrscellekulturer blitt demonstrert. I denne prosessen dyrkes pattedyrceller (CHO eller HEK-293) i en bioreaktor, og den rekombinante vektoren (ikke-viral) innføres i cellene ved bruk av en kjemisk transfeksjonsmetode som kalsiumfosfat eller polyetylenimin. Under passende forhold finner transient transkripsjon, oversettelse og posttranslasjonell behandling sted i vertscellene innen en kort tidsramme (1–14 dager). Selv om lave proteinproduksjonsutbytter, reproduserbarhet og oppskalering har vært utfordringene for forbigående genuttrykk i pattedyrcellekulturer, er det en lovende tilnærming for applikasjoner der tiden mellom genidentifikasjon og produkt er kritisk. Nylig, ved å optimalisere transfeksjonsmetoden og genvektorer, er rekombinante antistoffprodukttitere opp til 860 mg l -1 oppnådd i 2-l-skalaen ved bruk av forbigående genuttrykk i HEK-293-celler på 14 dager [18].

Oppsummert, selv om pattedyrceller er ganske effektive i sin evne til å produsere heterologe proteiner som oppfyller nødvendige produktkvalitetsspesifikasjoner, er bioreaktorbaserte pattedyrcellekulturprosesser iboende mer komplekse, dyre og tidkrevende å etablere.


Myocilinprotein i full lengde renses fra pattedyrceller som en dimer

Myocilin (MYOC) er et utskilt protein som finnes i humant vandig humor (AH) og mutasjoner i MYOC -genet er den vanligste mutasjonen som er observert hos glaukompasienter. Menneskelig AH analysert under ikke-reduserende forhold antyder at MYOC normalt ikke finnes i en monomer form, men snarere er hovedsakelig dimerisk. Selv om MYOC først ble rapportert for nesten 20 år siden, er en teknisk utfordring som forskere fortsatt står overfor, manglende evne til å isolere MYOC-protein i full lengde for eksperimentelle formål. Her beskriver vi to metoder for å isolere tilstrekkelige mengder humant MYOC-protein i full lengde fra pattedyrceller. En metode innebar identifisering av en cellelinje (HeLa S3) som ville utskille protein i full lengde (15 mg/L), mens den andre metoden innebar en rensetilnærming fra 293 celler som krever identifisering og modifisering av et internt MYOC-spaltingssted (Glu214/Leu215 ). MYOC proteinutbytte fra 293 celler ble forbedret ved mutasjon av to MYOC N-terminale cystein (C47 og C61) til seriner. Analytisk størrelsesekskluderingskromatografi av vårt MYOC-protein i full lengde renset fra 293 celler indikerte at det hovedsakelig er dimerisk, og vi foreslår en struktur for MYOC-dimeren. Vi håper at ved å tilby metoder for å skaffe MYOC -protein, vil forskere kunne bruke proteinet til å få ny innsikt i MYOC -biologien. Det endelige målet med MYOC -forskning er å forstå dette målet bedre, slik at vi kan hjelpe pasienten som bærer en MYOC -mutasjon med å beholde synet og opprettholde livskvaliteten.

Stikkord: Dimer Menneskelig vandig humor Modellert struktur Myocilin Proteinisolering Proteinrensing.


REAGENSER OG LØSNINGER

Kjerneisoleringsbuffer 1 (NIM1)

Denne bufferen brukes til å forberede NIM2, som brukes til å lage HB (trinn 2, Basic Protocol 2). Forbered på forhånd, bland komponentene nedenfor, og oppbevar i opptil 6 måneder ved 4 ° C. Mengder bør justeres basert på antall prøver som behandles.

Kjerneisoleringsbuffer 1 (NIM1)
Komponent Volum (µl) Sluttkonsentrasjon (mM)
for 1 prøve
1,5 M sukrose 625 250
(Sigma-Aldrich, kat.nr S0389)
2 M KCl 46.875 25
(Thermo Fisher Scientific, kat.nr. AM9640G)
1 M MgCl2 18.75 5
(Thermo Fisher Scientific, kat.nr. AM9530G)
1 M Tris‧Cl, pH 8 37.5 10
(Thermo Fisher Scientific, kattenr. AM9855G)
Nukleasefritt vann 3021.88
Total 3750

Kjerneisoleringsbuffer 2 (NIM2)

Denne bufferen brukes til å forberede HB (trinn 2, grunnleggende protokoll 2). Tilbered fersk, bland komponentene nedenfor, og ha på is. Disse tallene er beregnet slik at det er ledig volum tilgjengelig om nødvendig. Juster i henhold til antall prøver som behandles.

Kjerneisoleringsbuffer 2 (NIM2)
Komponent Volum (µl) Sluttkonsentrasjon (mM)
for 1 prøve
NIM1 (se oppskrift) 1246.25
1 mM DTT 1.25 1 uM
(Thermo Fisher Scientific, kat.nr P2325)
50 × Proteasehemmer 25
(Roche, kattenr. 11873580001)
Total 1250

Homogeniseringsbuffer (HB)

Tilbered fersk, bland komponentene nedenfor, og ha på is. Disse tallene er beregnet slik at det er ledig volum tilgjengelig om nødvendig. Juster i henhold til antall prøver som behandles. Se tabellen nedenfor.

Homogeniseringsbuffer
Komponent Volum (µl) for Sluttkonsentrasjon (mM)
1 prøve
NIM2 (se oppskrift) 1212.5
40 U/ul RNaseIn 12.5 0,4 U/ul
(Thermo Fisher Scientific, kat. Nr. AM2684)
20 U/ul Superase In 12.5 0,2 U/ul
(Invitrogen, kattenr. AM2696)
10% (v/v) Triton X-100 12.5 0.10%
(Sigma-Aldrich, kattenr. T8787-100ML)
Total 1250

Lagringsbuffer (SB)

Forbered fersk og ha på is. Disse tallene er beregnet slik at det er ledig volum tilgjengelig om nødvendig. Juster i henhold til antall prøver som behandles. Se tabellen nedenfor.

Lagringsbuffer
Komponent Volum (µl) for Sluttkonsentrasjon (mM)
1 prøve
Fosfatbufret saltvann (PBS1 × Invitrogen, kat.nr. 10010-049) 995
Bovint serumalbumin (BSA Sigma-Aldrich, kat.nr. A4503-10G) 40 mg 4%
40 U/µl Protector RNaseIn 5 0,2 U/ul
(Sigma-Aldrich, kattenr. 03335402001)
Total 1000

Produksjon av rekombinante transmembranproteiner fra mammale celler for biokjemiske og strukturelle analyser

Unit on Structural and Chemical Biology of Membrane Proteins, Neurosciences and Cellular and Structural Biology Division (NCSBD), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland

Unit on Structural and Chemical Biology of Membrane Proteins, Neurosciences and Cellular and Structural Biology Division (NCSBD), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland

Unit on Structural and Chemical Biology of Membrane Proteins, Neurosciences and Cellular and Structural Biology Division (NCSBD), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland

Unit on Structural and Chemical Biology of Membrane Proteins, Neurosciences and Cellular and Structural Biology Division (NCSBD), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland

Unit on Structural and Chemical Biology of Membrane Proteins, Neurosciences and Cellular and Structural Biology Division (NCSBD), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland

Unit on Structural and Chemical Biology of Membrane Proteins, Neurosciences and Cellular and Structural Biology Division (NCSBD), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland

Abstrakt

Eukaryote integrale membranproteiner er viktige komponenter i forskjellige biologiske prosesser. Fordi de er involvert i flere sykdommer, er det viktig å forstå deres virkningsmekanisme ved å belyse strukturen og funksjonen. Komplekse tekniske utfordringer knyttet til generering av rekombinante membranproteiner svekker vår evne til å forstå dem ved å bruke strukturelle og biokjemiske metoder alvorlig. Her gir vi en detaljert prosedyre for å håndtere og dempe vanskeligheter involvert i den store heterologe overuttrykk og rensing av eukaryote membranproteiner ved bruk av HEK293S GnTi-celler transdusert med baculovirus. To humane proteiner, hDHHC15 og hPORCN, presenteres som eksempler, med trinnvise instruksjoner for forbigående transfeksjon og generering av baculovirus, etterfulgt av overuttrykk og rensing fra HEK293S GnTi-celler. © 2020 Wiley Periodicals LLC.

Grunnprotokoll 1: Småskala proteinuttrykk i pattedyr HEK293T-celler

Grunnprotokoll 2: Generering av baculovirus fra Sf9 (insekt) celler

Alternativ protokoll: Metallfri metode for å generere P2 viral lager

Støtteprotokoll 1: Småskala transduksjon av HEK293T-celler med P2 baculovirus

Grunnprotokoll 3: Virustransduksjon i stor skala av HEK293S GnTi-celler

Støtteprotokoll 2: Membranpreparat i stor skala fra HEK293S GnTi-celler

Grunnprotokoll 4: Storskala rensing av membranproteiner fra HEK293S GnTi-celler


Rensing av DNA fra pattedyrprøver

En rekke sett tilbys for å isolere genomisk DNA fra et bredt spekter av pattedyrprøver, inkludert vev, blod og mushale.

OmniPrep & handel Genomisk DNA -isolasjon, OmniPrep og bytte for blod, OmniPrep og bytte for Tissue og OmniPrep & bytte for isolering av sett for mus er basert på rask nedbørsteknikk som bruker unike nedbørreagenser for å isolere genomisk DNA fri for proteiner og RNA.

MegaLong & trade isolerer kjerner under milde ekstraksjonsforhold og frigjør genomisk DNA ved fordøyelse av kjerneproteiner med en svært aktiv LongLife & trade Proteinase K. Fordøyelsen utføres i Tube-O-DIALYZER & tradea unik, patentert mikrodialyseenhet med en 0,45 & mikrometer membran, som minimerer prøven manipulasjon som er en av hovedårsakene til DNA -brudd.

GET & trade DNA Template og GET & trade DNA Template-Mag er basert på vår Genomic Efficient Technology (GET) som er designet for rensing av DNA-maler fra små prøver fra forskjellige prøvetyper. Den er basert på bruk av svært effektiv genomisk lyseringsbuffer for lysering av celleceller etterfulgt av immobilisering av nukleinsyrer på silika -spinnkolonne eller silika -magnetiske perler. Dette følges av vasketrinn og eluering for å oppnå genomisk DNA av høy kvalitet.

OmniTemplate & trade er spesielt designet for rask isolering av en DNA -mal i et enkelt rør for polymerasekjedereaksjon (PCR) analyse fra pattedyrvevsprøver, blod og cellekulturer.


WHEY OG WHEY POWDERS | Produksjon og bruk

Isolering og fraksjonering av protein

I motsetning til utfelling av myseproteiner ved varmebehandling ved fremstilling av laktalbumin, har proteinisolering og fraksjoneringsmetoder som mål å skille proteinene fra myse i en slik form at de så langt som mulig forblir fullstendig udenaturerte og dermed beholder sin funksjonelle funksjon. Disse produktene (proteinkonsentrater og isolater) har et høyt proteininnhold og kan ha eksepsjonelle funksjonelle egenskaper av betydelig verdi for næringsmiddelindustrien.

Proteinkonsentrater inneholder myseproteinene i omtrent samme proporsjoner som i myse. (Vær oppmerksom på at i denne artikkelen brukes begrepet 'proteinkonsentrater' for høyproteinprodukter som inneholder de individuelle myseproteinene i omtrent samme forhold som det som finnes i myse. Begrepet 'myseproteinkonsentrat' brukes for slike produkter produsert ved ultrafiltrering, og begrepene 'proteinisolater' og 'proteinfraksjoner' brukes for å referere til høyproteinprodukter med et høyere forhold mellom et bestemt protein enn det som finnes i myse.) Slike proteinkonsentrater produseres vanligvis ved bruk av en uspesifikk absorbent for å binde proteinene i myse, etterfulgt av eluering av proteinene ved behandling av absorbenten med et spesifikt elueringsmiddel. Absorberingsmidler som har blitt kommersielt brukt inkluderer karboksy-metylcellulose og en rekke mineraloksider. Selv om disse absorbentene er relativt uspesifikke, kan de vise en preferanse for binding av bestemte proteiner under angitte betingelser for pH, temperatur og ionestyrke. Dermed kan disse prosessene brukes til å produsere proteinisolater, for eksempel med et høyere forhold mellom ß-laktoglobulin og α-laktalbumin enn det som er tilstede i myse.

Proteinfraksjoneringsteknologi er også under utvikling, som er avhengig av separasjon av α-laktalbumin fra β-laktoglobulin på grunnlag av deres forskjellige løseligheter under angitte betingelser for pH, temperatur og ionestyrke. Det er derfor mulig å for eksempel skille det meste av α-laktalbuminet fra myse ved sedimentasjon ved nøye manipulering av behandlingsbetingelsene. Både α-laktalbuminet som har sedimentert og det gjenværende oppløselige proteinet (for det meste β-laktoglobulin) er relativt udaturert og beholder dermed sin høye funksjonalitet. Betingelsene som benyttes i disse prosessene er svært milde og resulterer ikke i noen denaturering av myseproteinene. Med slike prosesser er det derfor mulig å produsere isolater som er rike på β-laktoglobulin (med en ekstremt høy gelstyrke) og α-laktalbumin (et produkt som kan ha et betydelig potensial i ikke-allergene babymat).


Tilgangsalternativer

Få full journaltilgang i 1 år

Alle priser er NETTO -priser.
MVA blir lagt til senere i kassen.
Skatteberegningen vil bli fullført under kassen.

Få tidsbegrenset eller full artikkeltilgang på ReadCube.

Alle priser er NETTO -priser.


Proteinekstraksjon og amp Lysis Buffer (PE LB ™) -systemer

Proteinekstraksjon og amp Lysis Buffer (PE LB & trade) -systemene sikrer god proteingjenoppretting, samtidig som proteinets biologiske aktivitet opprettholdes. De solubiliserte proteinene er egnet for enzymanalyser, elektroforese, foldestudier, kromatografiske studier og mange andre nedstrømsapplikasjoner.

PE LB & trade -systemene tilbyr et bredt utvalg av buffere for lysering og ekstraksjon av proteiner fra bakterier, gjær, pattedyrceller og pattedyrvev. PE LB & handelssystemene er basert på en proprietær kombinasjon av organiske buffermidler, milde ikke-ioniske vaskemidler og en kombinasjon av forskjellige salter for å øke ekstraksjonen av proteiner og opprettholde stabiliteten til proteiners biologiske aktiviteter.

For å komplimentere denne familien med lyserings- og ekstraksjonsbuffere har vi optimalisert ProteaseArrest TM og Protease-PhosphataseArrest. Disse protease- og fosfatasehemmerne beskytter proteiner av interesse mot nedbrytning og er kompatible med alle våre lyseringsbuffere.


Samtidig ekstraksjon av proteiner og metabolitter fra celler i kultur

Riktig prøveforberedelse er en integrert del av alle omics -tilnærminger, og kan drastisk påvirke resultatene av et stort antall analyser. Siden metabolomics og proteomics forskningsmetoder ofte gir komplementær informasjon, er det ønskelig å ha en prøveforberedelsesprosedyre som kan gi informasjon for begge typer analyser fra den samme cellepopulasjonen. Denne protokollen forklarer en metode for separasjon og isolering av metabolitter og proteiner fra den samme biologiske prøven, for bruk nedstrøms i metabolomics og proteomics analyser samtidig. På denne måten kan to forskjellige nivåer av biologisk regulering studeres i en enkelt prøve, og minimere variansen som ville skyldes flere eksperimenter. Denne protokollen kan brukes med både vedheftende og suspensjonelle cellekulturer, og ekstraksjonen av metabolitter fra cellulært medium er også detaljert, slik at mobil opptak og sekresjon av metabolitter kan kvantifiseres.

Fordelene med denne teknikken inkluderer: 1.

Billig og rask å utføre denne metoden krever ingen sett.

Kan brukes på alle celler i kulturen, inkludert cellelinjer og primære celler ekstrahert fra levende organismer.

Et bredt spekter av forskjellige analyseteknikker kan brukes, og gir tilleggsverdi til metabolomiske data analysert fra en prøve, dette er av høy verdi i eksperimentell systembiologi.


Se videoen: Hvordan isolere en vegg med Sinnasnekkern (August 2022).