Informasjon

13: Etter transkripsjonsregulering av genuttrykk - biologi

13: Etter transkripsjonsregulering av genuttrykk - biologi



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

  • 13.1: Innledning
    Det metabolske potensialet til celler er fleksibelt, avhengig av forskjellige mekanismer som til slutt bestemmer nivåene og aktivitetene til proteiner som dikterer en celles metabolske tilstand. Vi har sett noen av disse reguleringsmekanismene. I dette kapitlet ser vi på forskjellige typer post-transkripsjonell regulering, hendelser et sted mellom mRNA-transkripsjon og kontroller av aktiviteten til ferdige proteiner. Disse kontrollmekanismene er mest forskjellige i eukaryoter.
  • 13.2: Post-transkripsjonell kontroll av genuttrykk
    For ikke så lenge siden trodde vi at veldig lite av det eukaryote genomet noen gang ble transkribert. Vi trodde også at de eneste ikke-kodende RNA-ene var tRNA og rRNA. Nå vet vi at andre RNA spiller roller i genregulering og nedbrytning av brukt cellulært DNA eller uønsket fremmed DNA. Disse diskuteres i detalj nedenfor.
  • 13.3: Eukaryotisk regulering av oversettelse
    På mange måter ligner den generelle prosessen den prokaryote oversettelsesinitieringen som er beskrevet andre steder. 40S -ribosomale underenhet kan selv binde til og skanne et mRNA og søker startstedet til en ORF (åpen leseramme) som koder for et polypeptid. Når GTP-bundet eukaryot startfaktor 2 (GTP-eIF2) binder met-tRNAf, danner det et ternært kompleks (TC).
  • 13.4: Nøkkelord og vilkår

Miniatyrbilde: N-koblet proteinglykosylering (N-glykosylering av N-glykaner) ved Asn-rester (Asn-x-Ser/Thr-motiver) i glykoproteiner. (Offentlig eiendom; Kosi Gramatikoff).


Post-transkripsjonell regulering av adaptermolekyler med IL-10 hemmer TLR-mediert aktivering av antigenpresenterende celler

Tolllignende reseptorer (TLR) virker for å føle miljøet for mikrobielle produkter og sender faresignaler til antigenpresenterende celler (APCer), noe som resulterer i aktivering av komplekse immunresponser. I denne studien analyserte vi funksjonen til humane monocyttavledede APC generert in vitro i nærvær av interleukin (IL) -10 ved aktivering av TLR-ligander. Eksponering av disse APCene for IL-10 resulterte i en skjev fenotypisk modning som respons på stimuli levert av TLR-ligandene, en redusert cytokinproduksjon, slik som IL-12, IL-6 eller tumornekrosefaktor-alfa, og nedsatt evne til å stimulere T-celle aktivering. Videre ble oppregulering av CCR7 i APC-er eksponert for TLR-stimulering samt migrasjon mot CCL19/MIP-3beta sterkt redusert. Det ble funnet at IL-10 nedregulerte MyD88, IRAK1 (IL-1-reseptorassosiert kinase) og tumornekrosefaktorreseptorassosiert faktor 6, essensielle adaptermolekyler for TLR-signalering, og for å redusere TLR-indusert kjernefaglig uttrykk for kjernefaktor-kappaB transkripsjonsfaktorer c-Rel og Rel-B samt interferon regulatorisk faktor (IRF) -3 og IRF-8. Dette skyldtes ikke inhiberingen av den mitogenaktiverte proteinkinasebanen, men ble heller formidlet av blokkering av PI3K-signalkaskaden. Interessant nok var inhiberingen av proteiner involvert i TLR-signalering, slik som MyD88, IRAK1 og pattedyrmål for rapamycin, på grunn av en selektiv post-transkripsjonsregulering.


Post-transkripsjonell regulering av humant brystkreftcelleproteom av uligandert østrogenreseptor β via mikroRNA

Østrogenreseptor β (ERβ) er medlem av den kjernefysiske reseptorfamilien til homeostatiske regulatorer som ofte går tapt ved brystkreft (BC), hvor dets tilstedeværelse korrelerer med en bedre prognose og et mindre aggressivt klinisk utfall av sykdommen. I motsetning til ERα, den nærmeste homologen, viser ERβ betydelige østrogenuavhengige aktiviteter, inkludert evnen til å hemme cellesyklusprogresjon og regulere gentranskripsjon i fravær av liganden. Ved å undersøke arten og omfanget av denne konstituerende aktiviteten til ERβ i BC MCF-7 og ZR-75.1-celler ved hjelp av mikroRNA (miRNA) sekvensering, identifiserte vi 30 miRNA differensielt uttrykt i ERβ+ versus ERβ-celler i fravær av ligand, inkludert oppregulert oncosuppressor miRs slik miR-30a. I tillegg ble en betydelig brøkdel av & gt1 600 unike proteiner identifisert i MCF-7-celler med iTRAQ kvantitativ proteomikk enten økt eller redusert med ERβ, og avslørte regulering av flere celleveier med ligandfrie reseptorer. Transkriptomanalyse viste at for et stort antall proteiner regulert av ERβ, er de tilsvarende mRNAene upåvirket, inkludert et stort antall antatte mål for ERβ-regulerte miRNA, noe som indikerer en sentral rolle for miRNAs i å formidle BC-celleproteomregulering av ERβ. Uttrykk for en etterligning av miR-30a-5p, et direkte mål og nedstrøms effektor av ERβ i BC, førte til identifisering av flere målutskrifter av dette miRNA, inkludert 11 kodende proteiner hvis intracellulære konsentrasjon ble betydelig påvirket av uligandert reseptor. Disse resultatene viser en signifikant effekt av ligandfri ERβ på BC-cellefunksjoner via modulering av celleproteomet og antyder at miRNA-regulering kan representere en sentral hendelse i kontrollen av den biologiske og kliniske fenotypen av hormonresponsiv BC av denne atomreseptoren.


Diskusjon

VEGF-cytokinet spiller en stor rolle i kreft ved å kontrollere ny-vaskularisering i solide svulster [[13]]. Ved leddgikt stimulerer VEGF vaskularisering som støtter den 'tumorlignende' fenotypen av det betente synovium [[12]]. Imidlertid spiller VEGF også en rolle i vaskulær permeabilitet og som kjemoattraktant [[11, 12, 14]], noe som tyder på at VEGFs rolle i betente ledd kan være kompleks. Makrofager i revmatiske ledd produserer VEGF [[1]], og vi har funnet ut at VEGFR-1 er oppregulert i aktiverte makrofager (K. Roy, R. Fava, RC Nichols, upubliserte data). Sammen antyder disse fakta at makrofager på stedet for betennelse både reagerer på VEGF og bidrar til den inflammatoriske responsen ved å produsere VEGF -protein. I denne rapporten bekrefter vi at makrofager reagerer på VEGF og andre inflammatoriske mediatorer ved å øke VEGF -produksjonen. Vi viser også at makrofager produserer flere mRNA VEGF isoformer, og stabiliteten til VEGF mRNA øker i aktiverte celler. Vi demonstrerer at makrofagaktivering øker ekspresjonen til VEGF -luciferase -journalister som inneholder musen VEGF 3 ′ UTR -regionen, og vi presenterer kartleggingsanalyse av VEGF 3 ′ UTR. Sammen viser disse resultatene at VEGF-ekspresjon, som i kreftmodeller, kontrolleres på post-transkripsjonelt nivå i makrofaglignende celler.

Økt produksjon av VEGF har vist seg å virke både av transkripsjonelle og post-transkripsjonelle mekanismer [[13]]. Post-transkripsjonell regulering involverer mRNA-bindende proteiner som virker cis elementer for å endre mRNA -stabilitet eller effektiviteten av translation [[32]]. Post-transkripsjonell regulering påvirker VEGF-produksjon i en kreftmodell [[18]], men det er uklart om post-transkripsjonell regulering påvirker VEGF-genuttrykk i makrofagceller. For å løse dette viser vi her at under forhold der VEGF -proteinproduksjon øker: (a) VEGF mRNA -nivåer økte (figur 2A) og (b) VEGF mRNA -stabilitet økte (figur 2B). Imidlertid kan disse økningene i VEGF mRNA og proteinproduksjon også delvis skyldes økt transkripsjon. Vi vurderer for tiden transkripsjonsregulering i aktiverte makrofager, og rapporterer her kun studier av 3 ′ UTR-mediert regulering.

Å studere regulatorisk cis elementer i VEGF mRNA introduserte vi 3 ′ UTR av mVEGF mRNA i 3 ′ UTR av luciferase -genet i en reporterkonstruksjon. Ved å bruke denne metoden kan vi skille post-transkripsjonsregulering fra både transkripsjonell regulering av den opprinnelige VEGF-promotoren og post-translasjonell regulering som virker på VEGF-proteinet. Vi viser i både monocytt-makrofaglignende RAW-264.7-celler og tioglykollat-fremkallede makrofager at introduksjonen av 3 ′ UTR-konstruksjonen i full lengde reduserte luciferase-mRNA-nivåer og redusert basal reporteraktivitet (figur 4B, C, D). Deretter viser vi at under forhold der VEGF mRNA er stabilisert (LPS -aktivering), økte luciferase -reporteraktiviteten. Disse resultatene antyder at 3 ′ UTR i VEGF mRNA bidrar til økningen i VEGF mRNA og protein funnet når makrofager stimuleres. Vi er de første som viser at 3 ′ UTR av VEGF mRNA påvirker genuttrykk i makrofager.

Post-transkripsjonell regulering av mRNA medieres av mRNA-bindende proteiner som gjenkjenner cis-virkende elementer, som oftest finnes i 3 ′ UTR-regionen [[26-28]]. De mest studerte cis-virkende elementer er AURE. Analyse av det menneskelige genomet anslår at 8% av humane mRNA inneholder AURE [[42]]. Tre klasser av AURE er identifisert [[26, 27]], og 3 ′ UTR av VEGF mRNA inneholder to av disse AURE -klassene: (a) Klasse I, ikke -overlappende AUUUA -pentamerer og UUAUUUA A /U A /U nonamer (b) Klasse III, adenosin-uridinrike og uridinrike sekvenser som mangler AURE-pentamerer. Flere rapporter har analysert AU-rike elementer i rotte og humant VEGF 3 ′ UTR [[19, 21-23, 43, 44]]. Ett klasse III AURE -element som ble identifisert i rotte -VEGF er ikke konservert hos mus eller mennesker [[20]]. En annen type cis element, som vi omtaler som et CAU-rikt element (CAURE), inneholder adenosin, uridin og cytidinrester, og CAURE er identifisert i GLUT1 mRNA [[45]] (nt 2180–90) og i 3 ′ UTR av VEGF mRNA [[23, 25, 28, 46]]. HnRNP L -bindingssetet (nt 322–342) [[25]], HuR -bindingssetet (nt 1622–1665) [[23, 46]] og CSD/PTB -kompleksbindingsstedet (nt 1727–39) [[28 ]] i 3 ′ UTR av VEGF mRNA er CAU-rike. Her presenterer vi vår analyse av 3 ′ UTR-mediert regulering i musemakrofagceller.

3 ′ UTR av mVEGF mRNA inneholder cis elementer i både de proksimale og distale områdene [[21, 22, 25, 43, 47]]. De distale to tredjedeler av 3 ′ UTR-musen inneholder seks AURE-pentamerer, to nonomer, to CAURE og syv ekstra regioner med 10 eller flere AU-nukleotider som mangler AUUUA-pentamerer. Flere grupper har vist det cis elementer i den distale regionen har sterke effekter på VEGF -genuttrykk under hypoksisk stress [[22, 46]]. Under normoksi disse distale cis elementer bidrar til VEGF mRNA ustabilitet. Det var derfor overraskende å finne at da den distale regionen til 3 ′ UTR ble fjernet (for å lage VEGF-209–750-luc) reporteraktivitet var lik den for reporteren i full lengde (fig. 5). I tillegg viste celler stimulert med LPS eller med VEGF økt VEGF-209–750-luc journalistaktivitet. I kontrast, VEGF-751–1747-luc reporter reagerte dårlig på mobilaktivering (data ikke vist), noe som antydet at regulatoriske elementer som er aktive i makrofager bor i den proksimale regionen i VEGF 3 ′ UTR.

Den proksimale regionen til 3 ′ UTR inneholder en CAURE i hVEGF som gjenkjennes av hnRNP L under både normoksiske og hypoksiske forhold i M21 melanomceller [[25]]. Den homologe musesekvensen er nesten identisk med den menneskelige CAURE, og sletting av hnRNP L-elementet resulterte i en nedgang i reporteraktivitet i ubehandlede RAW-264.7-celler. Aktiviteten til villtypen og VEGF-dL-luc journalister økte begge i celler behandlet med LPS (fig. 6). Behandling med hVEGF ga lignende resultater (data ikke vist). Selv om det ikke er noen AUUUA-pentamerer i nt 209–750-regionen, er det en lang AU-rik region (78-nt, 97% adenosin-uridin) som er tandem til hnRNP L-elementet. Denne AURE er interessant fordi vi fant at GLUT1-AURE luciferase-reporteren, som også er en lang ikke-AUUUA klasse III, var veldig aktiv i RAW-264.7 celler (figur 3). Fremtidige studier vil avgjøre om dette AURE eller annet ikke -kanonisk cis elementer i den proksimale regionen bidrar til 3 ′ UTR-avhengig regulering i makrofager.

Tre midler som stimulerer makrofager (LPS, LTA og VEGF) økte VEGF 3 ′ UTR-avhengig reporteraktivitet. En mekanisme vi vurderte var at disse midlene virker ved først å stimulere produksjonen av TNFα, og deretter stimulerer TNFα VEGF -genuttrykk. For å undersøke dette viste vi først at LPS stimulerte produksjonen av TNFα (data ikke vist). Deretter bestemte vi oss for om TNFα påvirket VEGF 3 ′ UTR-avhengig reporteraktivitet. Selv om TNFα -behandling økte VEGF -proteinproduksjonen, fant vi at TNFα -behandling redusert VEGF-FL-luc reporteraktivitet beskjeden, men betydelig (≈10% data ikke vist). Vi konkluderer med at post-transkripsjonell stimulering av VEGF-genuttrykk med agenter som LPS og VEGF ikke virker gjennom TNFα av en autokrin mekanisme.

Aktivering av VEGF-genuttrykk i RAW-264.7-celler med LPS og VEGF var forskjellig fra behandlinger med TNFα. Behandling med TNFα reduserte reporteraktiviteten og økte VEGF -proteinproduksjonen. Behandling med LPS eller med VEGF -protein økte både reporteraktivitet og VEGF -proteinproduksjon. Imidlertid var effekten av LPS på VEGF -proteinproduksjon beskjeden sammenlignet med effekten av VEGF -behandling. Disse forskjellige profilene for VEGF -genregulering av TNFα, VEGF og LPS kan skyldes forskjellige genaktiveringsmekanismer. Våre resultater antyder at: (i) TNFα stimulerer VEGF-produksjon ved en transkripsjonell mekanisme, men hemmer den post-transkripsjonelle banen (ii) behandling med VEGF stimulerer både transkripsjonelle og post-transkripsjonelle veier (iii) behandling med LPS virker utelukkende gjennom en post- transkripsjonell mekanisme, og påvirker ikke VEGF -transkripsjon. Studier av effekten av disse midlene på transkripsjon pågår. Hvis LPS utelukkende virker etter en post-transkripsjonell mekanisme, er det nødvendig med langsiktige studier for å avgjøre om de beskjedne effektene av LPS resulterer i tilstrekkelig produksjon av VEGF til å starte VEGF-drevet autokrin produksjon av VEGF. Viktigere, våre resultater tyder på at post-transkripsjonell regulering av VEGF kan være viktig under forhold der TNFα ikke er aktiv, inkludert under terapeutiske forhold der TNFα-virkning er blokkert.

Opprinnelig identifisert som en permeabilitetsfaktor, er VEGF nå kjent for å spille en vesentlig rolle i arteriogenese [[13]], ny-vaskularisering ved kreft [[13]] og inflammatoriske sykdommer [[12]]. Våre studier med makrofager viser at 3 ′ UTR av VEGF bidrar til genuttrykk og gir et nytt mål for behandling av aktiv sykdom. Post-transkripsjonell regulering av VEGF i makrofager formidles av virkningen av VEGF på dens beslektede reseptor, VEGFR-1. Regulering av VEGF ved en autokrin mekanisme ved kreft har blitt gjennomgått [[48]]. Det er mulig at VEGF og dets reseptor interagerer intracellulært for å regulere VEGF -genuttrykk [[48]]. Reguleringsmekanismen for makrofagen VEGF-reseptor, VEGFR-1, er nå under utredning for å avgjøre om VEGF-protein og dets reseptor er koordinert regulert.


Post-transkripsjonell regulering av det humane lever/bein/nyre alkaliske fosfatase-genet

Osteoblaster uttrykker høye nivåer av lever/bein/nyre alkalisk fosfatase (LBK AP), et enzym som er kritisk for beindannelse. Andre vev og celletyper uttrykker generelt mye lavere nivåer av LBK AP og tilsvarende lavere nivåer av mRNA. I lys av våre tidlige observasjoner om at den menneskelige LBK AP-promotoren uttrykkes likt når den transfekteres til en rekke forskjellige celler, har vi utført en detaljert studie av LBK AP-genuttrykk i Saos-2-celler som er osteoblast-avledet og uttrykker høye nivåer av LBK AP mRNA, og i HepG2 hepatoblastomceller som uttrykker LBK AP mRNA på nivåer som er omtrent 1000 ganger lavere. Resultatene våre indikerer at begge disse cellene bruker de samme promotorsekvensene for å starte transkripsjon av deres LBK AP -gener med omtrent samme hastighet. Videre er stabiliteten til cytoplasmatisk LBK AP mRNA lik i begge celletyper. Mangelen på noen tilsynelatende oppbygging av usplittet forløper -mRNA i kjernen til HepG2 -celler fører oss til den konklusjonen at spleising (og atomeksport) er ekvivalent. Det er derfor sannsynlig at differensialuttrykk blir kontrollert på et veldig tidlig trinn etter transkripsjon, muligens av sekvenser som destabiliserer det begynnende RNA i HepG2-celler. Vi resonnerer med at disse destabiliserende sekvensene er lokalisert i genets introner fordi et transfektert LBK AP -minigen, som består av full lengde cDNA og flankerende sekvenser, uttrykkes effektivt i begge celletyper.


Sykluser av genuttrykk og genomrespons under regenerering av pattedyrvev

Bakgrunn: Kompenserende leverhyperplasi eller regenerering indusert av to tredjedeler delvis hepatektomi (PH) tillater studier av synkronisert aktivering av pattedyrgenuttrykk, spesielt i forhold til celleproliferasjon. Her målte vi genomiske transkripsjonelle responser og mRNA -akkumuleringsendringer etter PH- og lureoperasjoner.

Resultater: I løpet av de første 10-20 timene var PH- og sham-kirurgiske responser veldig like, inkludert parallell tidlig aktivering av gener i celledivisjonssyklus. Etter 20 timer, mens post-PH lever fortsatt med en robust og koordinert celledeling-syklus genuttrykkrespons før de returnerte til hviletilstand med 1 uke, returnerte sham-kirurgiske lever direkte til en hvilende genuttrykkstilstand. Lokalisering av RNA -polymerase II (Pol II) og trimetylert histon H3 lysin 4 (H3K4me3) og 36 (H3K36me3) på gener som var i hvilende lever og aktivert under PH -responsen avslørte en generell de novo promotor Pol II rekruttering og H3K4me3 økning under den tidlige 10-20 timers fasen etterfulgt av Pol II-forlengelse og H3K36me3-akkumulering i genlegemer under den senere spredningsfasen. H3K36me3, som vanligvis dukket opp ved den første interne eksonen, gikk foran 5 'med H3K36me2 3' til den første interne eksonen, i omtrent halvparten av gener H3K36me3 dominerte og i den andre halvdelen eksisterte H3K36me2 og H3K36me3 samtidig. Videre observerte vi noen uvanlige genprofiler med rikelig Pol II, men lite tydelig H3K4me3 eller H3K36me3 modifikasjon, noe som indikerer at disse modifikasjonene verken er universelle eller viktige partnere til Pol II transkripsjon.

Konklusjoner: PH og sham kirurgiske prosedyrer på mus avslører slående tidlige postoperative genuttrykklikheter etterfulgt av synkronisert mRNA-akkumulering og epigenetiske histonmerkeendringer som er spesifikke for PH.

Stikkord: Genuttrykk Histonmodifikasjon Leverregenerering Delvis hepatektomi -transkripsjon.

Figurer

Genuttrykksprofiler etter svindel og ...

Gen-ekspresjonsprofiler etter sham og PH-kirurgi. en Dendogram over hierarkisk klynge av ...

Endrer Post-PH genuttrykksmønstre og ...

Endring av post-PH-genuttrykksmønstre og sammenligning med prøvesykeoperasjoner. en Varmekartvisning av…

Transkripsjon-overflod endringer av 124 ...

Transkripsjon-overflod endringer av 124 Mus musculus KEGG cellesyklusgener post-sham og post-PH.…

Post-PH genomiske svar for ...

Post-PH genomiske responser for de divergerende transkriberte PH-induserte Ska1 og ikke-PH-indusert Cxxc1 gener.…

Post-PH genomiske responser av gener ...

Post-PH genomiske responser av gener aktivert av PH (Post-PH gener). H3K4me3 (grønn), Pol…

Relativ opphopning av H3K36me2 og ...

Relativ akkumulering av H3K36me2 og H3K36me3 merker i gener. en 170 kb genom ...

Genomiske responser av akuttresponsen ...

Genomiske responser av den akutte responsen Saa gener etter PH. en 45 kb genomvisning ...

Grafisk oppsummering av syklisk genuttrykk ...

Grafisk oppsummering av sykliske genuttrykkssvar på lurv- og PH-operasjoner. Grønn, delt ...


Abstrakt

Etter oppkjøpet av kloroplaster og mitokondrier av eukaryote celler under endosymbiotisk evolusjon, gikk de fleste genene i disse organellene enten tapt eller overført til kjernen. Koding av organellebestemte proteiner i kjernen tillater vertskontroll av organellen. Til gjengjeld sender organeller signaler til kjernen for å koordinere kjernefysiske og organelle aktiviteter. I fotosyntetiske eukaryoter eksisterer det ytterligere interaksjoner mellom mitokondrier og kloroplaster. Her gjennomgår vi de siste fremskrittene med å belyse de intracellulære signalveiene som koordinerer genuttrykk mellom organeller og kjernen, med fokus på fotosyntetiske planter.


Resultater

COPD Airway Epitelceller er redusert GPX-1 Uttrykk

GPX-1-responser ble undersøkt i primære humane SAE-celler isolert fra NS og personer med KOL. Vi fokuserte på denne celletypen fordi dysfunksjon av de små luftveiene er sentralt i patogenesen av denne sykdommen (23). Først genuttrykket av SOD1 og GPX gener 1 𠄴 ble undersøkt i SAE -celler isolert fra NS og personer med KOL, med genuttrykk i forhold til hverandre. I SAE -celler, GPX-1 var det høyeste uttrykte antioksidantgenet som ble testet (figur 1A). SAE -celler fra personer med KOL uttrykker betydelig mindre GPX-1. Dessuten ble disse andre antioksidanter ikke signifikant endret i tilstanden KOLS sykdom, og ingen kompenserte for tapet av GPX-1 i denne sykdommen (figur 1A). I motsetning til den forhøyede GPX-2 og GPX-3 ekspresjon til stede i lungeprøver av personer med KOL (24), betydelig redusert GPX-1 genuttrykk ble notert i SAE -celler fra personer med KOL (figur 1B). CSE -administrasjon forbedret GPX-1 uttrykk i SAE -celler fra ikke -røykere, men ikke fra SAE -celler isolert fra personer med KOL (figur 1C). Denne sløvheten av GPX-1 mRNA-uttrykk korresponderte med GPX-1-aktivitet (figur 1D) og totale GPX-1-proteinnivåer (figur 1E). Dermed oppstår det en defekt i GPX-1-respons og generell GPX1-antioksidantkapasitet i de små luftveiene til personer med KOL.

Små luftveisepitelceller (SAE) fra organdonorer med kronisk obstruktiv lungesykdom (KOL) har redusert respons av glutationperoxidase (GPX) -1. (EN) Superoksiddismutase (SOD) -1 og GPX gener ble kvantifisert i SAE -celler isolert fra ikke -røykere friske individer (NS) og personer med KOL ved kvantitativ PCR (qPCR), og er vist som relative mRNA -nivåer for hvert antioksidantgen sammenlignet med ikke -røyker GPX-1 mRNA nivåer. (B) SAE -celler isolert fra ikke -røykere og pasienter med KOL ble dyrket og GPX-1 mRNA -uttrykk bestemt av qPCR. (C) Celler ble behandlet med kjøretøy eller 5% sigarettrøykstrakt (CSE) i 24 timer før det ble bestemt GPX-1 mRNA -uttrykk bestemt av qPCR. (D) Proteinlysater ble undersøkt for GPX-1-aktivitet ved enzymatiske analyser. (E) Totalt GPX-1-nivå ble bestemt i Western blots for GPX-1. β-aktin ble brukt som lastekontroll. Optisk intensitetskvantifisering og beregnede forhold mellom total GPX-1 og β-aktin ble bestemt, og presenteres som densitometri-enheter (DU). Grafer er representert som gjennomsnitt   ±  SEM. *P  < 𠂐.05, når du sammenligner begge behandlingene forbundet med en linje. All analyse hadde en n  ≥ 𠂓 per gruppe. Sammenligningene mellom to individuelle grupper ble bestemt av studentene t test eller større enn to grupper med enveis ANOVA og Tukey ’s post hoc tester. RQ   =  relativ kvantifisering.

Kronisk røykeksponering hemmer GPX-1 Uttrykk hos mus

For ytterligere å bestemme forholdet mellom røykeksponering, GPX-1-uttrykk og aktivitet, ble A/J-mus utsatt for sigarettrøyk i flere tidspunkter opptil 2 måneder.#X020142 måneder ble valgt fordi vi tidligere fant at denne musestammen utvikler emfysematøse endringer innen denne tidsperioden (25). Akutt eksponering for sigarettrøyk (opptil 8 d) forbedret GPX-1 uttrykk (figur 2A), men disse endringene var forbigående og GPX-1 tilbake til baseline etter subakutt eksponering (1 mo). Derimot førte en kronisk 2-måneders røykeksponering til tap av lunge GPX-1 mRNA -ekspresjon, bestemt av qPCR (figur 2A) og enzymatisk aktivitet (figur 2B). Redusert total lunge-GPX-aktivitet ble også observert hos røykutsatte dyr (figur 2B). Immunobloter bekreftet at Gpx-1 lunge nivåer reduseres etter 2 måneders eksponering for sigarettrøyk i A/J mus (figur 2C). Disse funnene er i samsvar med tidligere bevis som viser at GPX-1-aktivitet reduseres etter kronisk røykeksponering (3). Merk at den totale Gpx-1-aktiviteten også ble redusert (figur 2B) hos disse musene, noe som indikerer at andre Gpx-arter ikke kompenserer for tapet av Gpx-1.

Vurdering av røykeksponeringsvarighet på lungegpx-1-uttrykk hos mus. (EN) Tidsavhengige endringer i lungene GPX-1 uttrykk for røykeksponering hos mus ble evaluert med qPCR. (B) Total Gpx-1-aktivitet og Gpx-1-aktivitet og (C) totalt proteinuttrykk for Gpx-1 ble målt ved henholdsvis enzymatiske analyser og Western blots. β-aktin ble brukt som belastningskontroll og proteinnivåer ble kvantifisert ved densitometrisk analyse. (D) Lungekonformitet ble målt hos mus utsatt for sigarettrøyk på forskjellige tidspunkter opptil 2 måneder. Gjennomsnittlig lineær avskjærings (MLI) analyse, en estimator av volum-til-overflate-forholdet til acinar-luftromskomplekset, ble også målt i de samme musene. Grafer er representert som gjennomsnitt   ±  SEM av tre målinger. *P  < 𠂐.05, når man sammenligner begge behandlingene koblet med en linje bestemt av enveis ANOVA og Tukey ’s post hoc tester. All analyse hadde n  ≥ 𠂖 per gruppe.

Vi analyserte lungekonformitet og betyr lineær avskjæring hos mus utsatt for sigarettrøyk i 2 måneder for å undersøke hvordan GPX-1 uttrykk korrelert med røykmedierte endringer i lungefunksjon og morfometri. A/J -mus utsatt for sigarettrøyk i 2 måneder viste endringer i begge parametrene, i samsvar med utviklingen av emfysem (figur 2D). Viktigere er at disse fysiologiske og emfysematøse endringene skjedde samtidig med redusert GPX-1 uttrykk og aktivitet. Derfor var kronisk røykeksponering assosiert med reduserte GPX-1-ekspresjonsnivåer, både i SAE-celler og i muselunger. Dette gjør at vi kan bruke disse in vitro og in vivo modeller for å undersøke faktorene som nedregulerer GPX-1-uttrykk ved KOLS.

GPX-1 mRNA -nedbrytning akselereres i epitel av emner med KOLS

For å vurdere om det reduserte uttrykket for GPX-1 i KOLS luftveisepitel skyldtes mRNA -stabilitet, undersøkte vi GPX-1 mRNA -ekspresjon og forfallshastighet i SAE -celler samlet fra NS og personer med KOL. For å bestemme mRNA -forfallshastigheten kvantifiserte vi mengden av GPX-1 mRNA gjenstår på forskjellige tidspunkter etter actinomycin D -behandling. LDH -analyser ble utført for å etablere en actinomycin D -konsentrasjon som ikke induserte toksisitet. Ved 100 ng/ml induserte aktinomycin D ingen signifikant frigjøring av LDH fra SAE -celler (figur 3A), og denne konsentrasjonen ble brukt i påfølgende eksperimenter. Ved behandling med actinomycin D, GPX-1 mRNA degraderte raskere i celler fra pasienter med KOL sammenlignet med celler fra NS (figur 3B). En betydelig nedgang i GPX-1 mRNA -stabilitet ble observert innen 5 minutter etter actinomycin D -behandling i celler fra personer med KOL. Dette stod i kontrast til andre antioksidantgener, GPX-2, -3, og -4 og SOD1, som alle var stabile over 1 time etter actinomycin D -behandling i NS -celler (figur 3C). Dette indikerer at en redusert mRNA-halveringstid er minst delvis ansvarlig for de reduserte nivåene av GPX-1 mRNA i luftveisepitelceller fra personer med KOLS.

Forbedret GPX-1-mRNA-nedbrytning i KOLS-epitelprøver. (EN) Laktatdehydrogenase (LDH) frigjøringsanalyser ble utført i SAE -celler fra NS -donorer behandlet med actinomycin D. (B) GPX-1-ekspresjon ble målt med qPCR i SAE-celler fra NS og pasient med KOL-celler behandlet med 100 ng/ml aktinomycin D og samlet på forskjellige tidspunkter etter behandling. RQ ble uttrykt sammenlignet med tid null for actinomycin D -behandling for NS- og KOL -prøver. (C) Genuttrykk av GPX-1, GPX-2, GPX-3, GPX-4, og SOD1 ble bestemt ved bruk av qPCR i aktinomycin D – -behandlede SAE -celler fra NS. Grafer er representert som gjennomsnitt   ±  SEM av tre målinger. *P  < 𠂐.05, når du sammenligner begge behandlingene samtidig. All analyse hadde en n  = 𠂖 per gruppe. Sammenligningene mellom to individuelle grupper ble bestemt av studentene t test eller større enn to grupper med enveis ANOVA og Tukey ’s post hoc tester.

GPX-1 mRNA-ustabilitet medieres av c-Src-aktivering

Regulering av GPX-1 ble tidligere rapportert å være kontrollert av c-Abl og Arg tyrosinkinaser (17). Vi og andre observerte også at tyrosinkinasen, c-Src, fosforyleres og aktiveres ved røykeksponering (16). Derfor undersøkte vi om c-Abl og c-Src kunne mekle GPX-1 genuttrykk og nedbrytning av mRNA. Nrf2, c-Abl, og c-Src uttrykk ble dempet ved bruk av siRNA. Nrf2 ble undersøkt, ettersom det er en viktig regulator av antioksidantresponser (26). Etter 30 minutter etter behandling med c-Src siRNA og actinomycin D, økt GPX-1 ble observert i SAE -celler fra NS (figur 4A). I motsetning, c-Abl eller Nrf2 lyddemping hadde ingen effekt på GPX-1 uttrykk (figur 4A). Vi bekreftet c-Abl, c-Src, og Nrf2 gendemping av qPCR (figur 4A). Demping c-Src stabilisert GPX-1 mRNA i over 2 timer etter administrering av actinomycin D (figur 4B). SAE-celler fra personer med KOL har økt c-Src kinaseaktivitet sammenlignet med SAE-celler fra NS SAE-celler (figur 4C). Derfor fastslår disse funnene at c-Src regulerer GPX-1-nivåer i luftveisepitelet ved KOLS. Målretting mot den økte c-Src-aktiviteten som oppstår ved KOL kan gjenopprette GPX-1-nivåene for å motvirke skadelige inflammatoriske og proteolytiske responser i humane luftveisepitelceller.

Tyrosinkinasen c-Src regulerer GPX-1 mRNA -nedbrytning i KOLS -epitel. (EN) SAE-celler fra NS ble transfektert med siRNA spesifikt for c-Abl, c-Src, Nrf2 eller kryptert kontroll og 48 timer senere behandlet med 100 ng/ml aktinomycin D i 30 minutter. Genuttrykk av GPX-1 ble bestemt ved bruk av qPCR. Representant qPCR viser knockdown av hvert mål og GPX-1 nivå. β-aktin ble brukt som lastekontroll. (B) GPX-1 ekspresjon ble også undersøkt i c-Src –-silerte celler opptil 2 timer etter 100 ng/ml actinomycin D-behandling. (C) Relativ c-Src-aktivitet ble bestemt i SAE-celler fra NS og personer med KOL. Grafer er representert som gjennomsnitt   ±  SEM av tre målinger. *P  < 𠂐.05, når du sammenligner begge behandlingene forbundet med en linje. All analyse hadde en n  ≥ 𠂔 per gruppe for qPCR og aktivitetsanalyser. Sammenligningene mellom to individuelle grupper ble bestemt av studentene t test.

Kjemisk hemming av Src-aktivitet forbedrer GPX-1-nivåene

Fordi c-Src-demping forbedret GPX-1-respons, ble effekten av to Src kinasehemmere, dasatinib og saracatinib, undersøkt i SAE-celler. Saracatinib hemmer Src og Bcr-Abl tyrosinkinaseaktivitet, og dasatinib blokkerer Src og Bcr-Abl tyrosinkinaser, c-KIT, EPHA2 (Ephrin type A reseptor 2) og PDGFR β (trombocytavledet vekstfaktor beta). Immunoblotanalyse bestemte at dasatinib ved konsentrasjoner større enn eller lik 1 nM induserte ekspresjon av GPX-1 og blokkert fosforylering av Src ved tyrosinsted 416 (figur 5A). Fosforylering av Src -kinaser på tyrosin 416 -stedet induserer tyrosinkinaseaktivitet (27). Behandlingen av SAE-celler med 0,5 μM saracatinib induserte GPX-1-ekspresjon og hemmet Src-fosforylering og c-Src-aktivitet (figur 5B). LDH release assays were undertaken to test cell viability after dasatinib and saracatinib treatment, and showed no toxicity at the concentrations used ( Figures 5A and 5B ). SAE cells treated with saracatinib had enhanced GPX-2 gene expression ( Figure 5C ). Therefore, inhibition of c-Src by dasatinib and saracatinib enhances GPX responses in the airway epithelium.

Inhibition of the tyrosine kinase c-Src enhances GPX-1 mRNA in epithelia. Media for SAE cells isolated from NS were supplemented with (EN) dasatinib or (B) saracatinib for 24 hours and immunoblots for p-Src (Tyr416), GPX-1, and β-actin were performed. Densitometry for the ratio of GPX-1 to β-actin was assessed. LDH release assays were performed for the media of dasatinib- or saracatinib-treated cells to determine toxicity. (B) Relative c-Src activity was determined in SAE cells from NS treated with saracatinib. (C) SOD1 and GPX genes were quantified in SAE cells isolated from subjects with COPD after treatment with saracatinib for 24 hours, by qPCR. Graphs are presented as mean ± SEM of three measurements. *P <𠂐.05, when comparing both treatments connected by a line. All analysis had a n ≥𠂔 per group for qPCR and activity assays. The comparisons between two individual groups were determined by Student’s t test or multiple groups with ANOVA with Tukey’s post hoc test analysis. p = phosphate.

Because Src kinase inhibition enhances GPX-1 levels in vitro, we investigated the therapeutic effects of saracatinib on smoke-induced c-Src activity and GPX-1 suppression in vivo. Our group previously demonstrated that saracatinib could reduce cigarette smoke–induced emphysema in mice (16). The results of these studies now define a targetable mechanism for this protective effect. Daily saracatinib administration prevented the reduction in lung Gpx-1 expression mediated by 2 months of cigarette smoke exposure ( Figure 6A ). As expected, saracatinib treatment inhibited c-Src activation in smoke-exposed mice ( Figure 6A ). Gpx-1 immunoblots confirmed that saracatinib treatment maintained lung Gpx-1 protein levels of smoke-exposed animals ( Figure 6B ). Interestingly, saracatinib treatment induced expression of Gpx-1, Gpx-3, og Sod1, while partially reducing GPX-2 expression ( Figure 6C ). Therefore, elevated c-Src signaling is, in part, responsible for the reduced expression of GPX-1 in the airways of subjects with COPD. Moreover, this shows, for the first time, that inhibiting c-Src could preserve GPX-1 levels after chronic cigarette smoke exposure in the lung.

Saracatinib treatment prevents cigarette smoke–induced inhibition of Gpx-1 expression in mice. A/J mice were exposed to cigarette smoke daily for 2 months in combination with daily oral administration of vehicle or saracatinib (AZD-0530). (EN) Gpx-1 gene expression and c-Src activity were determined by qPCR and enzymatic activity assays, respectively. (B) Immunoblots for p-Src (Tyr416), GPX-1, and β-actin were performed. Densitometry for the ratio of GPX-1 to β-actin was assessed. (C) SOD1 and GPX genes were quantified in vehicle- and saracatinib-treated animals, by qPCR. Graphs are represented as mean ± SEM of n ≥𠂕 animals per group. *P <𠂐.05, when comparing both treatments connected by a line. RA = room air.


13: Post Transcriptional Regulation of Gene Expression - Biology

The transcriptional regulatory mechanisms in heart muscle that direct cardiac development and allow for a flexible, adaptive response to physiologic stress are not well understood. We demonstrate that a negative regulator of gene transcription termed Id that has been described predominantly in proliferating cell lines and in undifferentiated tissue during growth, is expressed in freshly isolated terminally differentiated adult rat ventricular myocytes, in contrast to most other tissues in the adult rat. Id mRNA expression is regulated in ventricular myocytes during post-natal development, peaking at the transition from hyperplastic to hypertrophic growth at day 17 in the rat, declining subsequently to lower, stable levels in adult myocytes. Although Id mRNA becomes undetectable in adult ventricular myocytes 48 h following isolation in the absence of serum, it can be rapidly reinduced by an alpha-adrenergic agonist, accompanied by increased protein synthesis and the reexpression, in defined media, of the neonatal genes prepro-ANP and skeletal muscle alpha-actin. Thus, the differential regulation of Id during cardiac development, the presence of Id mRNA in normal cardiac myocytes, and its increased expression following a hypertrophic stimulus all suggest a role for this transcriptional regulator in the control of cardiac muscle cell phenotype.


13: Post Transcriptional Regulation of Gene Expression - Biology

Hypoxia is a pro-fibrotic stimulus, which is associated with enhanced collagen synthesis, as well as with augmented collagen prolyl 4-hydroxylase (C-P4H) activity. C-P4H activity is controlled mainly by regulated expression of the α C-P4H subunit. In this study we demonstrate that the increased synthesis of C-P4H-α(I) protein in human HT1080 fibroblasts under long term hypoxia (36 h, 1% oxygen) is controlled at the translational level. This is mediated by an interaction of RNA-binding protein nucleolin (∼64 kDa form) at the 5′- and 3′-untranslated regions (UTR) of the mRNA. The 5′/3′-UTR-dependent mechanism elevates the C-P4H-α(I) expression rate 2.3-fold, and participates in a 5.3-fold increased protein level under long term hypoxia. The interaction of nucleolin at the 5′-UTR occurs directly and depends on the existence of an AU-rich element. Statistical evaluation of the ∼64-kDa nucleolin/RNA interaction studies revealed a core binding sequence, corresponding to UAAAUC or AAAUCU. At the 3′-UTR, nucleolin assembles indirectly via protein/protein interaction, with the help of another 3′-UTR-binding protein, presumably annexin A2. The increased protein level of the ∼64-kDa nucleolin under hypoxia can be attributed to an autocatalytic cleavage of a high molecular weight nucleolin form, without alterations in nucleolin mRNA concentration. Thus, the alteration of translational efficiency by nucleolin, which occurs through a hypoxia inducible factor independent pathway, is an important step in C-P4H-α(I) regulation under hypoxia.


Se videoen: Bab 4 Sebatian Kimiapart 3 (August 2022).