Informasjon

Kan oksaloacetat krysse den ytre mitokondriemembranen?

Kan oksaloacetat krysse den ytre mitokondriemembranen?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Jeg er klar over Malate-Aspartate Shuttle, men noe er ikke klart for meg, og forskjellige kilder ser ut til å motsi hverandre. Noen viser at oksaloacetat (OAA) reduseres til malat i mitokondriell intermembranrom (IMS), mens andre viser reduksjonen som skjer i cytosolen.

Hvor skjer OAA → malatreduksjon? dvs. kan OAA krysse den ytre mitokondriemembranen (fra cytosolen til IMS) slik at den kan reduseres i IMS, eller må den reduseres i cytosolen før du krysser en av de to mitokondriemembranene?


Generelt antas den ytre mitokondriemembranen å være i utgangspunktet permeabel (gjennom poriner) for små molekyler som OAA. Som det er typisk for biologi, kan situasjonen faktisk være mer kompleks - se for eksempel denne artikkelen. Men jeg tror standardantagelsen er at metabolitter fritt krysser den mitokondriale ytre membranen.

Du kan også spørre om enten det mitokondriale MDH eller det cytoplasmatiske MDH -enzymet sannsynligvis vil bli funnet eller være aktivt inne i intermembranrommet.


Oksaloacetat (OAA) kan ikke krysse den indre mitokondriemembranen.

Prosessen med oksidativ fosforylering og elektrontransportsystemet (ETS) forekommer i mitokondrion, mens $ ce {NADH} $ generert ved reduksjon av $ ce {NAD+} $ i glykolyse er i cytoplasma. Problemet er at den indre mitokondriemembranen ikke er permeabel for $ ce {NADH} $, så det kreves et skyttelsystem for transport av reduserende ekvivalenter gjennom mitokondriemembranen. Det er to av disse, hvorav den ene er 'Malate-Aspertate' -bussen.

I prosessen (se ovenfor) oksaloacetat (OAA) tar opp reduserende ekvivalenter fra $ ce {NADH} $ for å danne malat i en reaksjon katalysert av malat dehydrogenase. Den indre mitokondriemembranen er permeabel for malat, som passerer gjennom bærerproteiner (Malate-$ alpha $ -ketogluterat transportør) inn i mitokondriell matrise der den omdannes tilbake til OAA. Etter hvert som dette skjer, reduseres konsentrasjonen av OAA i mellommembranrommet, og ettersom OAA ikke kan passere direkte gjennom den indre mitokondriemembranen, blir den omdannet til aspartat i mitokondriell matrise ved å reagere med glutamat for å produsere $ alfa $ -ketoglutarat og aspartat. Aspartatet beveger seg deretter til mellommembranrommet gjennom spesifikke bærere (Glutamat-aspartat-transportør). I intermembranrommet kombineres aspartatet med $ alfa $ -ketoglutarat for å danne glutamat og OAA (motsatt av det som skjedde i mitokondriell matrise). Konsentrasjonen av OAA opprettholdes således i mellommembranrommet, og reaksjonen fortsetter.

Konklusjon

OAA omdannes til malat i mellommembranrommet. I mitokondriell matrise konverteres malat tilbake til OAA, som illustrert i illustrasjonen nedenfor.

Bildekilde: Malate-Aspartate Shuttle, Wikipedia


Mitokondrier & huse for regulering av cellulær biokjemi: nye konsepter og nettverk

Mitokondrier er ikoniske strukturer innen biokjemi og cellebiologi, tradisjonelt referert til som cellens kraftverk på grunn av en sentral rolle i energiproduksjon. Imidlertid er dagens mitokondrier anerkjent som sentrale aktører innen eukaryot cellebiologi og er kjent for å regulere viktige cellulære prosesser, inkludert kalsiumsignalering, cellemetabolisme og celledød, for å nevne noen. I denne anmeldelsen vil vi diskutere grunnleggende kunnskap i mitokondriell biologi og gi øyeblikksbilder av de siste fremskrittene som viser hvordan mitokondriell funksjon regulerer andre mobilresponser.

1. Introduksjon

Alle dagens eukaryoter antas å ha oppstått fra en urfader som slukte et α-protobakterium med evne til å puste [1]. Denne hendelsen ga opphav til dagens mitokondrier, en hendelse som nå er dypt integrert i eukaryote cellehomeostase og overlevelse. Mitokondrier er dynamiske nettverk som er i stand til å omforme morfologi og aktivitet. De gir energi og biomolekyler for cellen, i tillegg til å bidra til veier for cellestress, immunresponser, intra- og intercellulær signalering, cellesykluskontroll og celledød. Den unike biologien til mitokondrier underbygger deres innflytelse på cellen og evnen til å kalibrere strukturen og proteomet er et effektivt middel for å tilpasse deres funksjon. Som sådan vil vi begynne med en kort oversikt over tre grunnleggende begreper i mitokondriell biologi: (i) mitokondriell ultrastruktur (ii) mitokondriell proteinimport og (iii) mitokondriell dynamikk. Dette vil informere senere diskusjon av mitokondrier som sentrale aktører i brede og mangfoldige roller, inkludert metabolisme, signaltransduksjon, immunitet, cellesyklus, celledifferensiering, celledød og stress.

2. Mitokondriell ultrastruktur, dynamikk og proteinimport

2.1. Mitokondriell ultrastruktur

Mitokondrier har en dobbel membran som definerer fire rom: den ytre membranen, intermembranrommet, den indre membranen og matrisen. Arkitekturen til den indre membranen er formbar og vanligvis innviklet i foldede invaginasjoner, kalt cristae, som dikterer det romlige arrangementet av proteiner [2]. Ombygging av cristae -strukturen til cristae kan også endre enzymatisk fluks mellom rommene, i samsvar med de forskjellige cristae -strukturene som er observert på tvers av celletyper med forskjellige metabolske krav [2]. Det nylig beskrevne MICOS -komplekset (mitokondrielt kontaktsted og cristae organisasjonssystem) er nødvendig for å opprettholde cristae morfologi [3] (figur 1). Tap av MICOS -montering ablater cristae -kryss og manifesterer alvorlige defekter i energimetabolismen, kalsiumhåndtering og lipidhandel [4]. Imidlertid er det fortsatt uklart hvordan MICOS reguleres av mobilforhold for å produsere forskjellige cristae -morfologier. Interessant nok endrer forstyrrelse av MICOS aktiviteten og/eller overflod av mitokondrielle morfologi proteiner [5,6]. Forstyrrelser i organelfunksjon har lenge vært forbundet med grove morfologiske endringer i mitokondrielt nettverk, derfor kan cristae -omorganisering ved MICOS -montering/demontering være et mellomledd mellom funksjon og dynamikk. Nylig identifiserte assosiasjoner mellom MICOS og proteinimportkomplekser peker på den brede innflytelsen fra MICOS på mitokondriell funksjon [7,8].

Figur 1. Nukleærkodede mitokondrielle proteiner importeres av translokaser med flere underenheter. Mitokondrielle proteiner syntetisert i cytosolen importeres til mitokondrier post-translasjonelt. TOM -komplekset ved den ytre membranen fungerer som en generell proteininngangsport. hTom40 danner porene til translokasen, mens hTom20, hTom22 og hTom70 fungerer som reseptorer. hTom22 spiller en ekstra rolle i monteringen av komplekset. hTom5, hTom6 og hTom7, samlet kalt de små TOM -ene, regulerer dynamikken og sammensetningen av komplekset. TIM22-komplekset ved den indre membranen formidler import av multipass-transmembranproteiner til den indre membranen. hTim22 danner porene gjennom hvilke proteiner settes inn, mens AGK og hTim29 fungerer som reseptorer og i kompleks samling. TIM23 -komplekset kan translokere forløperproteiner til matrisen eller den indre membranen. hTim23 og hTim17 danner kanalporene, og hTim50 fungerer som en reseptor for forløpere. Kjernekomplekset forbinder en importmotor som hjelper til med å translokere proteiner til matrisen på en ATP-avhengig måte. MIA -komplekset formidler import av oppløselige intermembrane romproteiner ved å katalysere dannelsen av disulfidbindinger. hMia40 utfører disulfidbindingsdannelsen og er forankret til den indre membranen gjennom en interaksjon med AIF. ALR fjerner elektroner fra hMia40 slik at den kan gjennomgå ytterligere runder med katalyse. SAM-komplekset i den ytre membranen formidler innsetting av β-fatproteiner i den ytre membranen. hSam50 er tilknyttet MTX1 og MTX2. Cristae, de store invaginasjonene i den indre mitokondriemembranen, stabiliseres av et kompleks med flere underenheter kalt MICOS. Mic60 er kjerneunderenheten til MICOS, som i tillegg inneholder Mic10, Mic13, Mic14, Mic19, Mic25, Mic26 og Mic27. MICOS assosierer også med SAM -komplekset ved den ytre membranen for å danne en struktur kjent som mitokondriell mellommembran mellomromskompleks (MIB).

(Anbefalt videre lesing om cristae, MICOS og ultrastruktur: [2,9,10].)

2.2. Mitokondriell proteinimport

Fra deres endosymbiont -opprinnelse har menneskelige mitokondrier beholdt bare 37 gener i et lite sirkulært genom kjent som mitokondrielt DNA (mtDNA), som koder for 13 polypeptider, 22 tRNA og 2 rRNA. De resterende 1000–1500 mitokondrielle proteiner er kjernekodede og må importeres og sorteres til det relevante mitokondrielle rommet etter syntese i cytosolen. Grunnleggende formidles mitokondriell proteinimport av multimeriske proteinkomplekser kjent som translokaser, som er lokalisert ved mitokondrier (figur 1). Kort fortalt bor to store translokaser i mitokondriens ytre membran: Translocase of the Outer Membrane (TOM) -komplekset og Sorting and Assembly Machinery (SAM). TOM -komplekset er det første kontaktpunktet for nesten alle mitokondrielle forløpere og gir et inngangsmiddel til organellen. Etter translokasjon gjennom TOM, divergerer forløperimportveier basert på målrettingsinformasjonen og den ultimate plasseringen i organellen. β-fatproteiner i den ytre membranen sorteres til SAM-komplekset for integrering i membranen. Det er to translokaser innebygd i den indre membranen i mitokondrier: Translocase of the Inner Membrane (TIM) 22 og 23 (TIM22 og TIM23) komplekser. TIM22 formidler innsetting av ikke-spaltbare polytopiske membranproteiner i den indre membranen, mens TIM23-komplekset er ansvarlig for å importere forløpere på tvers av den indre membranen til matrisen eller i noen tilfeller kan frigjøre transmembrane forløpere til den indre membranen. Til slutt formidler Mitochondrial Intermembrane space Assembly (MIA) maskiner import av små cysteinrike intermembrane romproteiner og kobler deres import til oksidasjon [11]. Disse importveiene og maskinene har hovedsakelig vært karakterisert i sopporganismer, men i de senere årene har analyse i høyere eukaryoter avdekket viktige fysiologiske konsekvenser på grunn av forstyrrelser i proteinimport. Spesielt forårsaker mutasjoner i gener som koder for proteinimportunderenheter distinkte mitokondrielle sykdommer med fenotyper som spenner fra alvorlige muskeldefekter til nevrodegenerasjon og medfødte vekstdefekter [12].

(Anbefalt videre lesing om mitokondriell proteinimport: [13–15].)

2.3. Mitokondriell dynamikk: fisjon, fusjon og kontaktorganer for organeller

Som et organellært nettverk gjennomgår mitokondrier fisjon og fusjon for å replikere, resirkuleres og endre deres bioenergi. Fusjon av den ytre membranen medieres av homotypiske interaksjoner mellom GTPasene Mfn1 og Mfn2 på tilstøtende mitokondrier (figur 2) [16], men de involverte domenene og trinnvis fusjonsmekanisme er fortsatt diskutert. Fusjon av den indre membranen styres av Opa1, som eksisterer som fem isoformer generert av mRNA -spleising og proteolytisk spaltning (figur 2) [17]. Det antas at støkiometrien til disse isoformene styrer Opa1-interaksjoner med det mitokondrie-spesifikke lipidkardiolipinet og senere fusjonshendelser [18]. Mitokondriell fusjon er forbundet med økt ATP -produksjon ved oksidativ fosforylering og beskytter mot oksidativt og proteostatisk stress [19]. Motsatt er mitokondriell fisjon samtidig med en avhengighet av glykolyse og går foran mitokondriell omsetning. Fisjon er i stor grad avhengig av det dynaminrelaterte og cytosoliske proteinet Drp1, som oligomeriserer rundt og begrenser mitokondrielle tubuli (figur 2). Rekruttering av Drp1 fra cytosolen krever adapterproteiner på den mitokondriale ytre membranen, inkludert Mff, Mid49 og Mid51 [20,21], selv om menneskelig Fis1 kan fremme Drp1-uavhengig mitokondriell fragmentering gjennom inhibering av fusjonsproteiner [22] (figur 2) . Selv om det er foreslått motstridende modeller for rekruttering av Drp1, er lokalisering og aktivitet kjent for å være regulert av en rekke post-translasjonelle modifikasjoner [23]. Skjæringsevnen til Drp1-oligomerer er sterisk begrenset til tubuli opp til 250 nm diameter, noe som indikerer at for-innsnevring er nødvendig for større mitokondrier [24]. Dette oppnås ved det endoplasmatiske retikulum (ER), som vikler rundt og innsnevrer tubuli for å markere fremtidige fisjoner og hjelpe til med korrekt oppdeling av mitokondrielt innhold [25,26].

Figur 2. Cellemaskinerier som formidler mitokondriell fisjon, fusjon og dannelse av kontaktsteder med det endoplasmatiske retikulum. Mitokondrier gjennomgår kontinuerlig fisjon og fusjon. Fisjon formidles av GTPase Drp1, som kan rekrutteres til den ytre mitokondriemembranen av en rekke reseptorer, inkludert Mff, Fis1, Mid49 og Mid51. Drp1 ved den ytre membranen kan oligomerisere til fibriller som begrenser mitokondrier for å starte fisjon. Mitokondriell fusjon initieres ved tetting av mitokondrier gjennom homotypiske interaksjoner mellom Mfn1 og Mfn2 på motstridende mitokondrier. Indre membransmelting formidles av OPA1, som eksisterer som lange og korte former generert gjennom proteolyse. Kontaktsteder mellom mitokondriene og det endoplasmatiske retikulum (ER) etableres og vedlikeholdes gjennom protein -protein -interaksjoner. Interaksjoner oppstår mellom Mfn2 -molekyler på ER -membranen og den ytre mitokondriemembranen, og mellom VAPB på ER -membranen og RMDN3 på den mitokondriale ytre membranen. Interaksjoner forekommer også mellom IP3R3, en kalsiumkanal på ER -membranen, og VDAC1 og hTom70 på den mitokondriale ytre membranen.

Mitokondrier deltar også i omfattende dynamiske inter-organelle kontakter som koordinerer funksjonelle utvekslinger mellom mitokondrier og andre cellulære komponenter [27]. Spesielt letter ER - mitokondrier -kontaktsider (ERMC) en rekke funksjoner, inkludert mitokondriell fisjon, koenzym Q -biosyntese, lipidoverføring, Ca 2+ overføring, mtDNA -replikasjon og autofagi [25,26,28–31]. ER - mitokondrier -møtestrukturen (ERMES) har vært godt karakterisert i Saccharomyces cerevisiae [32], men ingen menneskelig ekvivalent er identifisert [33]. Foreløpig arbeid hos mennesker tyder på at metazoan ERMC er knyttet til interaksjoner mellom hTom70 og IP3R3, VDAC1 og IP3R3, RMDN3 og VAPB, Mfn2 homodimerer, Vps13a og Pdzd8 med en ukjent partner (figur 2) [34–39]. Videre har acetylerte mikrotubuli "spor" blitt foreslått for å opprettholde disse kontaktene til tross for bevegelser og ombygging av de to organellære nettverkene [40]. Andre kontakter mellom organer er beskrevet mellom mitokondrier og Golgi [27,41], peroksisomer [42], lysosomer [43], lipiddråper [44] og plasmamembranen [45]. Sammenkoblingen mellom mitokondrier og mobilkomponenter muliggjør betydelig samspill på tvers av forskjellige veier, eksempler som vi vil belyse gjennom denne anmeldelsen (tabell 1).

Tabell 1. Fullstendige navn og identifikatorer for proteiner diskutert i denne anmeldelsen.

(Anbefalt videre lesing om mitokondriell dynamikk: [46–48] om organellkontakter: [49–51].)

3. Mitokondrier og metabolisme

Mitokondrier er kjent for å gi energi til cellen, hovedsakelig ved å koble trikarboksylsyre (TCA) -syklusen til oksidativ fosforylering. TCA -syklusen er en serie med åtte enzymatiske reaksjoner som oppstår i matrisen for å høste elektroner fra sitrat og dets katabolske mellomprodukter (figur 3en). Den typiske inngangen til syklusen er acetyl-CoA, som kan produseres fra glukose (via glykolyse), fettsyrer (via β-oksidasjon) og aminosyrer (via deaminering) (figur 3en). Elektronene som fjernes gjennom syklusen overføres av NADH og FADH2 til kompleksene i elektrontransportkjeden. Komplekser I – IV av elektrontransportkjedens shuttle -elektroner, ved å bruke energien til å pumpe protoner inn i intermembranrommet og etablere en elektrokjemisk gradient over den indre membranen. Kompleks V (ATP -syntase) frigjør protonene tilbake til matrisen ved å bruke energien fra den elektrokjemiske gradienten til å produsere ATP, cellens energivaluta (figur 3en) [52]. Selv om oksidativ fosforylering normalt er effektiv, er det negativt regulert av akkumulering av dets giftige biprodukt, reaktive oksygenart (ROS). Hvis dette ikke er merket av, kan ROS forårsake skade på mitokondrier, indusere proteinaggregasjon og introdusere mutasjoner i DNA [53–55]. Nylige fremskritt innen kryoelektronmikroskopi har avslørt at kompleksene I, III og IV kan samles for å danne superkomplekser som antas å redusere mengden ROS produsert under elektrontransport, samt øke respirasjonsfrekvensen [56].

Figur 3. Mitokondrier koordinerer viktige metabolske prosesser. (en) Mitokondrier er best kjent for å ha plass til proteinmaskinene som kreves for å generere ATP. Når oksygen er tilgjengelig, vil de fleste celler generere ATP gjennom oksidativ fosforylering, hvor elektroner høstet gjennom katabolske reaksjoner brukes til å drive ATP -syntase. Elektroner oppnås gjennom TCA -syklusen, som forekommer i matrisen og består av åtte enzymatiske reaksjoner. Acetyl-CoA er den primære inputen for TCA-syklusen, og kan oppnås gjennom metabolisme av glukose, fettsyrer og aminosyrer. Elektroner ekstrahert under TCA -syklusen lastes på NAD + og FAD 2+. Elektroner blir deretter overført fra NADH og FADH2 på kompleksene I og II i elektrontransportkjeden. Elektroner ledes gjennom kompleksene III og IV, som transporterer protoner inn i det intermembrane rommet. Protoner får strømme tilbake til matrisen gjennom ATP -syntase (kompleks V), som bruker energien til protongradienten til å konvertere ADP til ATP. (b) Metokondriell en-karbon (1C) metabolisme består av en serie parallelle og reversible reaksjoner som oppstår i cytosol og mitokondriell matrise. I prolifererende celler foregår reaksjonen normalt i en bestemt retning slik at formiat produsert i mitokondrier kan brukes til biosyntetiske prosesser i cytosolen. Innenfor mitokondriene påvirkes THF og serin importert fra cytosolen sekvensielt av SHMT2, MTHFD2 og MTHFD1 L for å produsere formiat, som eksporteres tilbake til cytosolen. Cytosoliske MTHFD1 -belastninger formateres på THF for å danne ladede folat -mellomprodukter som kan brukes til å syntetisere purin- og pyrimidinnukleotider.Mitokondriell 1C -metabolisme er også en viktig kilde til glycin. (c) Mitokondriell matrise fungerer som et viktig lagringssted for kalsiumioner. Mitokondrielt kalsiumopptak skjer ofte på ER -kontaktsteder, hvor store mengder Ca 2+ kan frigjøres gjennom IP3R3. Kalsium kan passere fritt gjennom den ytre membranen via VDAC -kanaler og transporteres over det intermembrane rommet og den indre membranen gjennom den koordinerte funksjonen til en MICU1/MICU2 -dimmer som dokker til MCU i den indre membranen. Kalsium kan gå ut av mitokondriell matrise gjennom LETM1 eller SLC8B1 (i bytte for henholdsvis H + eller Na +) og kan krysse den ytre membranen gjennom VDAC eller NCX3.

Mitokondrier produserer også fettsyrer, aminosyrer, nukleotider og hemagrupper for cellen gjennom biosyntetiske veier [57–59]. En slik prosess, ett-karbon (1C) metabolisme, produserer glycin, metionin, nukleotider, fosfatidylkolin og 1C-enheter (metyllignende grupper) fra serinkatabolisme gjennom redoks-kjemi av folat og dets derivater (figur 3b) [60]. Disse 1C -enhetene lader den universelle metyldonoren S-adenosylmetionin som kreves for metylering av proteiner og kromatin [61]. Det er nå signifikant bevis på at metabolske enzymer og metabolitter endrer genuttrykk som journalister av miljøforhold (næringsstofftilgjengelighet, hypoksi, oksidativt stress) eller mitokondriell dysfunksjon. Dette har blitt vist for acetyl-CoA, TCA-mellomprodukter, ketoner, laktat, fettsyrer og aminosyrer [62–68]. Nye studier indikerer også cellulær nærings- og energifølelse ved mTOR kinase regulerer mitokondriell biogenese og proteinsyntese [69]. Gjennom nedstrøms effektorer av transkripsjon og oversettelse stimulerer mTORC1 mitokondriell biogenese og oksidativ metabolisme for å dekke energibehovet til anabolisme [70–72]. Interessant nok hemmer tumorsuppressoren p53 mTOR-mediert vekst og spredning for å forhindre onkogenese [73,74]. p53 -aktivitet øker elektrontransportkjedens effekt [75], mtDNA -stabilitet [76,77] og reduserte glutation (GSH) -nivåer [78] for å begrense ROS -produksjonen samt hemme glykolyse [79,80], noe som bidrar til det replikative potensialet til svulstceller [79,81,82]. Således er metabolisme intimt integrert med andre mobilnettveier, men er ikke mitokondriernes eneste bidrag til signalmekanismer.

(Anbefalt videre lesing om metabolisme: [60,83] om metabolittsignalering: [68,84] på mTOR/p53: [85,86].)

4. Signalering

4.1. Mitokondrier kontrollerer kalsiumhomeostase

Kalsiumioner er vanlige for forskjellige signalveier. Den ytre mitokondriemembranen er permeabel for Ca 2+, delvis på grunn av kanaldannende VDAC-proteiner [87] og eksport via SLC8A3 [88]. Det mitokondriale indre membran kalsium uniporter (MCU) komplekset regulerer transport inn i matrisen (figur 3c). Permeabiliteten til MCU -komplekset er kalibrert av to regulatoriske underenheter, MICU1 og MICU2, som er knyttet sammen med en intermolekylær disulfidbinding introdusert av hMia40 [89,90]. Mitokondriers evne til å akkumulere Ca 2+ opptil 20 ganger høyere konsentrasjoner enn cytosolen gjør at de kan fungere som buffersystemer og gjenopprette homeostase etter Ca 2+ bursts [91,92]. Bursts av Ca 2+ inn i cytosolen, fra tvers av plasmamembranen eller intracellulære lagre, kan starte frigjøring av nevrotransmitter, muskelfiberkontraksjon og transkripsjonell regulering. Hos nevroner modulerer mitokondriell Ca 2+ -buffering både tilbøyeligheten og varigheten av nevrotransmitterfrigjøring [93,94]. I hjertemuskulatur er sammentrekning koblet til forbedret mitokondriell ATP -produksjon via Ca 2+ -økede aktiviteter av TCA -syklusenzymer, kompleks V og ADP/ATP -transportøren [95–98] en effekt maksimert med lokale Ca 2+ konsentrasjoner ved ERMC [29] , 99] (figur 3c). I tillegg påvirker mitokondriell Ca 2+ -regulering hormonsekresjon [100], vevsregenerering [101] og interferon-β-signalering via mitokondrielt antiviralt signalprotein, MAVS [102].

(Anbefalt videre lesing om mitokondriell Ca 2+ signalering: [92,103,104].)

4.2. Mitokondrieres roller i immunresponser

Mitokondriers bidrag til immunresponsene er et voksende forskningsområde. Celle-autonom immunsignalering drives av MAVS ved den ytre membranen, som fungerer som et relépunkt for immunsignaltransduksjon. Rigglignende reseptorer i cytosolen gjennomgår konformasjonsendringer ved påvisning av viralt RNA eller DNA og rekrutteres til MAVS, spesielt ved ERMC [105]. MAVS dimererer deretter for å muliggjøre binding av flere signalstrømadaptere nedstrøms inkludert TRADD, TRAF3 og STING for å aktivere NF-KB og IRF-3/7-transkripsjon av interleukiner og proinflammatoriske cytokiner [106–108] (figur 4en). Interessant er det at MAVS-dimerer og mange av adapterne co-immunutfeller med hTom70 i TOM-komplekset, hvis overuttrykk øker signalresponsen [109]. MAVS -signalering påvirkes også av ROS og reguleres negativt av Nlrx1, en bindingspartner til kompleks III og MAVS [110,111] (figur 4en). Ettersom mitokondrielt proteinimport og oksidativ metabolisme kan bli kapret av virulensfaktorer [112], kan disse interaksjonene gjøre MAVS følsom for konsekvenser av infeksjon. Til slutt, hvis mitokondrier kompromitteres av infeksjon, kan økt ROS og frigjøring av mtDNA i cytosolen aktivere NLRP3 -inflammasomet for å fremkalle en inflammatorisk respons [113,114] (figur 4en).

Figur 4. Mitokondrier gir viktige bidrag til forskjellige mobilprosesser. (en) Den mitokondriale ytre membranen er stedet for viktige signalhendelser under den medfødte immunresponsen. Påvisning av virale nukleinsyrer ved hjelp av Rig-lignende reseptorer (RLR) induserer dimerisering av MAVS, et protein i den mitokondriale ytre membranen. Dimeriserte MAVS rekrutterer signaladaptere som starter nedstrøms aktivering av IRF3/7 og NF-KB, transkripsjonsfaktorer som induserer ekspresjon av type I-interferoner og proinflammatoriske cytokiner. MAVS er regulert av NLRX1, et protein som nedregulerer MAVS når det er lokalisert til den ytre membranen, men aktiverer MAVS når det er på den indre membranen ved å samhandle med kompleks III for å indusere ROS -produksjon. Frigjøring av mtDNA under infeksjon kan også aktivere NLRP3 -inflammasomet. (b) Mitofagi er en prosess som gjør at skadede mitokondrier kan identifiseres og ødelegges. Under normale forhold importeres PINK1 til mitokondrier og nedbrytes av PARL. Når mitokondrier er skadet, svekkes importen og PINK1 akkumuleres i TOM -komplekset ved den ytre membranen. Autofosforylert og aktivt PINK1 ved ytre membran fosforylerer monoubiquitinmolekyler på ytre membranproteiner, rekrutterer og aktiverer E3 ubiquitin ligase Parkin. Aktiverte Parkin syntetiserer polyubiquitinkjeder som rekrutterer autofagi -reseptorer for å starte mitofagi. (c) Mitokondrielt proteostatisk stress registreres gjennom partisjonering av transkripsjonsfaktoren ATF5 mellom mitokondriene og kjernen. Under normale forhold blir ATF5 importert til og sekvestrert i mitokondrier. Hvis mitokondriell proteinimport blir kompromittert, blir ATF5 handlet inn i kjernen, hvor den oppregulerer uttrykk for gener som forbedrer proteostase. (d) Mitokondrier spiller avgjørende roller i starten av apoptose. Som svar på pro-apoptotiske stimuli, oligomeriserer Bax og Bak i den ytre membranen for å danne porer som tillater utstrømning av apoptogene proteiner (cytokrom c, Diablo, AIF og Endonuclease G) fra intermembranrommet inn i cytosolen. Cytokrom c binder seg til Apaf-1 for å indusere dannelse av apoptosomet og aktivering av kaspaser. Diablo blokkerer hemmere av apoptose (IAP) som ellers ville dempe effekten av caspaser. AIF og Endonuklease G translokerer til kjernen der de bidrar til ødeleggelse av genomet.

Mitokondriell metabolisme leder også raske endringer til spesialiserte immunceller under infeksjon. Endringer i membranpotensialet kan aktivere eller undertrykke M2-makrofager [115,116] og M1-makrofager shunt mellomprodukter fra TCA-syklusen for å generere lystgass, IL-1β og den antibakterielle itakonsyren [117,118]. Videre er de fagocytiske evnene til makrofager avhengig av mitokondriell ROS -produksjon for å ødelegge internaliserte patogener [119]. Naive T-celler viser økning i mitokondriell masse, mtDNA-kopiantall, glykolyse og glutaminmetabolisme under differensiering for rask spredning og for å unnslippe hviletiden [120,121]. Metabolsk ombygging avgjør da også T-cellens modne skjebne [122,123], ved å endre cristae-arkitektur [124] eller ved direkte effekt av metabolitter på epigenetisk transkripsjonsregulering [125].

(Anbefalt videre lesing om mitokondrielt immunsignalering: [106,118,126].)

5. Cellesyklus, differensiering og død

Mitokondrier er implisitt knyttet til cellesykluskontroll som leverandører av energi og nukleotider, men de koordinerer også sjekkpunkter og reagerer på signaler om spredning. For å dekke det metabolske behovet for mitose, øker mitokondriell masse og membranpotensial fra G1/S til sent mitotisk stadium [127]. Faktisk hemmer hyperpolarisering og økt ATP-produksjon AMP-kinase for å tillate cyclinE-mediert inngang til S-fase [128]. I slutten av G2 -delingen S. cerevisiae, syklinB1/Cdk1 -komplekset trafikk til mitokondrier til fosforylering av kompleks I -underenheter og Tom6, som stimulerer oksidativ metabolisme både direkte og indirekte via økt proteinimport [129,130]. Under mitose fragmenteres et sterkt smeltet og retikulært mitokondrielt nettverk gradvis til små rørformede organeller som segregerer i påvente av cytokinesis [127,131]. Mitokondrier kan også forsinke cellesyklusprogresjon for å øke biogenesen [132], på grunn av utilstrekkelig nukleotidproduksjon [133], eller på grunn av ROS-akkumulering [134]. Videre kan fusjonsformidleren Mfn2 binde både Ras og Raf for å hemme proliferativ signalering [135].

Stamceldifferensiering er også avhengig av mitokondrier som en 'metabolsk bryter'. Menneskelige embryonale stamceller er glykolytiske, men de utvikler modne cristae, replikerer raskt mtDNA og øker ATP -produksjonen ved differensiering [136]. Ved hematopoetisk stamcelledifferensiering frigjør nedregulering av Pdk2, en hemmer av pyruvatdehydrogenase, undertrykkelse av acetyl-coA-produksjon og muliggjør oksidativ fosforylering [137]. Den påfølgende økningen i ROS -produksjon og oksidativ fosforylering under differensiering driver oppregulering av mitokondriale antioksidantproteiner av transkripsjonsfaktorene Oct4, Sox2 og Nanog [138]. Mitokondriell fusjon antas å lette disse metabolske endringene, selv om viktigheten av spesifikke proteiner og fisjon/fusjonsbalanse kan være celletypespesifikk [139–141]. Dette støttes av somatiske celleprogrammeringsstudier som viser sletting av Mfn2 tillater pluripotens ettersom glykolyse blir dominerende over oksidativ fosforylering [142] den samme effekten oppnås ved pluripotensfaktoren ZFP42 aktivering av Drp1 [143].

Hvis mobilforhold eller ytre fornærmelser er for harde, kan mitokondrier utløse flere former for celledød. Apoptose, eller programmert celledød, kan fremkalles fra ekstern signalering via Fas-, TRAIL- og TNFα -reseptorene eller iboende fornærmelser som DNA -skade, Ca 2+ overbelastning, ROS og ER -stress [144]. Mitokondrier bidrar til den ekstrinsiske banen, men er forbindelsen til den indre apoptotiske banen. I den siste veien oligomeriserer cytosolisk pro-apoptotisk Bax med Bak ved den ytre membranen for å permeabilisere mitokondrier og frigjøre pro-apoptotiske proteiner, inkludert cytokrom c, Diablo, Htra2, Endonuclease G og AIF (figur 4d) [145]. I cytosolen, cytokrom c kjerneformer dannelsen av apoptosomet og aktivering av caspasene som demonterer cellen på en immunologisk stille måte. Cytosolic Diablo og Htra2 blokkere hemmere av caspaseaktivering, som ellers ville beskytte cellen mot basal cytokrom c lekkasje [146,147]. Endonuklease G og AIF translokerer til kjernen til fragment DNA (figur 4d), Krever AIF først proteolytisk spaltning av sitt transmembrane domene [148–150]. AIF er normalt en del av intermembrane romimportmaskiner, eller MIA -kompleks, og forankrer oksidoreduktase hMia40 til den indre membranen. Det ytre membranproteinet VDAC2 beskytter mot apoptose ved å sekvestere Bak [151,152], men nye bevis tyder på at det kan være nødvendig for Bax-mediert apoptose [153]. Fremvoksende forskning impliserer også mitokondrier i alternative og mindre studerte celledødsveier som ROS-indusert nekrose [154], immunaktivert nekroptose [155], ferroptose [156,157] og partanotose [158].

(Anbefalt videre lesing om mitokondrier i cellesyklusen: [159 160] om differensiering [161–163] om celledød: [164 165].)

6. Mitokondriell kvalitetskontroll

Tapet av mitokondriell funksjon har store negative effekter på mobilhelsen, derfor har flere kvalitetskontroll- og stressresponsmekanismer utviklet seg. Det mitokondriale utfoldede proteinresponset (mtUPR) oppdager proteostatisk stress i mitokondriene [166]. Sentralt i mtUPR er transkripsjonsfaktoren ATF5. Når stress forårsaker proteinimport og/eller elektrontransportkjededysfunksjon akkumuleres ATF5 i kjernen for å transkribere mitokondrielle chaperoner og proteasegener (figur 4c) [167,168]. De Caenorhabditis elegans homolog ATFS-1 har også vist seg å undertrykke translasjon av elektrontransportkjedens underenhet og samlingsproteiner fra både mitokondrielle og kjernefysiske genomer [169]. Oversettelse av ATF5 styres delvis av dens homolog ATF4, som begge er oppregulert i den integrerte stressresponsen (ISR) [170,171]. ISR kan utløses av ER -stress, aminosyresult eller nedbrytning av hTim17A, en TIM23 kompleks underenhet [172,173]. ISR er preget av fosforylering av eIF2α, noe som fører til global reduksjon av translasjon og selektiv induksjon av cytoprotektive gener inkludert pro-survival MCL1 og autophagy proteiner. Dette illustrerer preferansen for clearance av defekte organeller fremfor kontrollert celledød selv om responsen kan endre seg med celletype eller fornærmelse [174].

Den selektive autofagiske klareringen av mitokondrier kalles mitofagi og kontrolleres av mitokondriell serin/treoninproteinkinase PINK1 og E3 ubiquitin ligase Parkin. PINK1 importeres konstitutivt til friske mitokondrier gjennom TOM -komplekset og frigjøres lateralt i den indre membranen av TIM23 [175] før spaltning av PARL -proteasen (figur 4b) [176]. Depolarisering av den indre membranen i defekte mitokondrier forhindrer import av PINK1, noe som får den til å oligomerisere ved det ytre membran TOM-komplekset [177], der den blir auto-fosforylert [178]. Dette utløser fosfo-PINK1-fosforylering av basal ytre membranmonoubiquitin og rekrutterer Parkin til raskt å poly-ubikvitinere ytre membranproteiner for rekruttering av autofagosomfaktorer (figur 4b) [179 180]. Nylige data tyder på at mitokondrier kan identifisere og starte mitofagi i spesifikke tubuli [181], mens mitofagi indusert av CSNK2/CK2 -fosforylering av hTom22, FUNDC1 og BCL2L13 antyder en potensiell cytoplasmatisk påvirkning eller vei [182–185]. I tillegg illustrerer observasjoner av transcellulær mitofagi i astrocytter at mye fremdeles er ukjent i disse prosessene [186].

Nye stressresponser dukker opp som demonstrerer den gjensidige kommunikasjonen mellom mitokondrier og cytoplasma. Ablasjon av MIA importveier i S. cerevisiae aktiverer proteasomet for å dempe mitokondriell forløperakkumulering i cytosolen [187]. Dette korrelerer med pattedyr, intermembran plass-spesifikk mtUPR (mtUPRIMS) der transkripsjonell aktivitet av ERRα oppregulerer intermembrane romproteaser og aktiverer proteasomet [188,189] proteasomet som tidligere ble vist å nedbryte utfoldede intermembrane romproteiner som retrotranslokerer til cytosol [190]. I S. cerevisiae, proteasomet er også engasjert av Ubx2 for å fjerne mitokondrielle proteinforløpere som ble arrestert under translokasjon, og blokkerte TOM -komplekset [191]. Gjensidig kan mitokondrier bryte ned defekte proteiner for å hjelpe cytosolisk proteostase. I S. cerevisiae, kan cytosolisk Vms1 fjerne feiloversatte mitokondrielle forløpere fra stoppede ribosomer og dirigere deres import for intra-mitokondriell nedbrytning [192] og aggregeringsutsatte cytosoliske proteiner kan importeres for intra-mitokondriell nedbrytning hvis cytosoliske Hsp70 mislykkes [193]. Spennende for videre forskning er rapporter om lysosomal fusjon av mitokondrier avledede vesikler beriket for ikke-nativt oksiderte proteiner [194,195] og ekstracellulær jettison av aggregater av nevroner i C. elegans [196].

(Anbefalt videre lesing om mitokondriell kvalitetskontroll: [197–199] om mitofagi: [200,201].)

7. Avsluttende kommentarer

Denne anmeldelsen illustrerer betydningen av mitokondrier for eukaryote mobilfunksjoner. Som mitokondrielle biologer blir vi ofte overrasket over nye veier eller proteinnettverk som involverer mitokondrier og/eller mitokondrielle proteiner. Mitokondriell proteinimport og strukturell dynamikk gir midler til raske endringer i aktiviteten for å lette biologiske reaksjoner på signalmolekyler, tilgjengelighet av næringsstoffer og patogen fornærmelse. Den tidsmessige koordineringen av mitokondriell energi og deres biosyntetiske kapasitet driver celleproliferasjon og differensiering. Imidlertid gjør den svært reaktive biokjemien som er delt i organellen den i stand til å indusere celledød og krever mekanismer for kvalitetskontroll. En forståelse av dette samspillet mellom mitokondrielle funksjoner og deres mangfoldige cellulære implikasjoner er derfor kritisk for en omfattende helhetlig modell for cellulær homeostase og biokjemi. Viktigheten av dette er tydelig i den eskalerende forekomsten av mitokondrier i post-genomisk medisinsk forskning [202]. Selv om mitokondrier unektelig er knutepunkter for cellulær biokjemi, er ytterligere grunnforskning nødvendig. Spesielt å belyse hvordan mitokondrion regulerer og integrerer de forskjellige veiene det er assosiert med, i spesialiserte celler/vevstyper og i sammenheng med helse og sykdom, vil bidra til å avdekke den sanne dybden av innflytelse denne fantastiske organellen har på eukaryote celler.


Oksidativ fosforylering

Bevegelse av elektroner fra cytoplasmatisk NADH til mitokondriell ETC

Intakte mitokondriemembraner er ugjennomtrengelig for NADH og NAD +, og for at glykolysen skal fortsette, NAD + må kontinuerlig regenereres i cytoplasma (se kapittel 26).Derfor blir reduserende ekvivalenter (dvs. elektroner) fra NADH, i stedet for NADH selv, båret over mitokondrielle membraner av enten malate (Mal) eller glyserol 3-fosfat ( Fig. 36-1 ), og dermed tillate cytoplasmatisk NAD + reformasjon, og for NADH og/eller FADH2 utnyttelse i mitokondriell ETC. I Mal shuttle, redusere ekvivalenter fra NADH blir akseptert av oksaloacetat (OAA), og dannes dermed Mal som krysser mitokondrielle membraner via en α-ketoglutarat (α-KG = )-Mal antiporter. Inne i mitokondrier, NADH regenereres fra Mal, og OAA, som heller ikke kan krysse mitokondrielle membraner, returneres til cytoplasma via reversibel konvertering til aspartat (Asp se kapittel 9 og 35). De amingruppe fra Asp blir overført til α-KG = i cytoplasma, og dannes dermed glutamat (Glu), som returneres til mitokondrier via en Asp-Glu antiporter. Inne i mitokondrier, Glu overfører sitt amingruppe til OAA, og dermed reformere Asp og fullføre skyttelbussen.

En annen bærer av reduserende ekvivalenter er glyserol 3-P, som i likhet med Mal og Asp lett krysser mitokondrielle membraner. Dette skyttelbuss overfører elektroner fra NADH til dihydroksyacetonfosfat (DHAP), og dannes dermed glyserol 3-P (og NAD +) i cytoplasma. Glyserol 3-P krysser deretter den ytre mitokondriemembranen, og blir reoksidert til DHAP ved FAD protesegruppe av glyserol 3-P dehydrogenase. FADH2 dannes dermed på den indre mitokondriemembranen, og DHAP diffunderer tilbake til cytosolen for å fullføre skyttelen. Hos noen arter reduseres aktiviteten til denne skyttelen etter tyroidektomi. Selv om den er tilstede i insektmuskulatur, hjernen, brunt fettvev, hvitt muskelvev og leveren til pattedyr, i andre vev (f.eks. Hjertemuskulatur), mitokondrie glyserol 3-P dehydrogenase er mangelfull. Det antas derfor at malate shuttle er mer universelt nyttig enn glyserol 3-P shuttle, spesielt siden 3 heller enn 2 ATP kan genereres per atom O2 forbrukes (se nedenfor).


2. Metabolisme av aminosyre i deler

2.1. Glutamin

Under fysiologiske forhold er glutamin en av de mest utbredte aminosyrene i sirkulasjon [4,5]. Glutamintilførselen er avledet fra både diettkilder og de novo -syntese, hvorav sistnevnte krever glutamat og ammoniakk og katalyseres av glutaminsyntetase (GS) i cytosolen. Aktiviteten til GS er godt beskrevet i hjernen som et middel for å fjerne overflødig ammoniakk av astrocytter, og dysfunksjonell ammoniakkmetabolisme kan føre til hepatisk encefalopati og cerebralt ødem [6,7]. I celler med høye formeringshastigheter (f.eks. Kreftceller, aktiverte T -lymfocytter), oppveier glutaminbehovet tilbudet og miljøtilgang blir ȁkondisjonelt essensiell ” [8,9,10,11,12]. Når næringsstoffer blir lokalt begrenset, kaprer flere kreftformer, inkludert bukspyttkjertelen, glioblastom og eggstokkene, stromal glutaminsyntese som en alternativ forsyningslinje for å oppfylle deres økte krav [13,14,15]. Videre undertrykker glutaminmangel ekspansjon av aktiverte T -lymfocytter, og konkurranse om næringsstoffer i vev kan påvirke immunresponsen mot patologiske tilstander som viser kjennetegn på økninger i næringsforbruket (f.eks. Virusinfeksjon, kreft) [10,16,17,18].

Overfloden av glutamin i sirkulasjon gjenspeiler dens robuste allsidighet for å tilfredsstille metabolske krav utover proteinoversettelse (figur 1). Glutaminolyse representerer en av de viktigste katabolske veiene som er viktige for generering av TCA-mellomledd, fettsyrer, reduserende ekvivalenter som er nødvendige for oksidativ fosforylering og ikke-essensielle aminosyrer. Det første trinnet i glutaminolyse skjer i mitokondriene og katalyseres av enzymet glutaminase (GLS), som omdanner glutamin til glutamat. Det er to isozymer av GLS, nyretypen (GLS1) og levertypen (GLS2) [19]. Mitokondri-produsert glutamat tjener en rekke direkte og indirekte metabolske roller. For eksempel kan glutamat oksideres av NAD (P) + -avhengig enzym glutamat dehydrogenase (GLUD1) eller bidra med dets aminogen nitrogen for ikke-essensiell aminosyresyntese ved cytosoliske og/eller mitokondriale transaminaser (f.eks. GOT1/2 for aspartat , PSAT1 for serin, GPT1/2 for alanin). Glutamat er også nødvendig for glutation (GSH) syntese og brukes som ryggrad for prolin og arginin biosyntese. På den annen side har katabolisme av andre aminosyrer (f.eks. Prolin) vist seg i flere sammenhenger å være en viktig kilde til glutamat. For å gi metabolsk fleksibilitet i næringsbegrensede tilstander, fjerner kreftceller i bukspyttkjertelen kollagenpeptider fra den ekstracellulære matrisen og bruker prolin som en anaplerotisk kilde når glutaminnivået er lavt [20]. Videre har prolinkatabolisme av prolin dehydrogenase (PRODH) også vist seg å være en viktig kilde til glutamat ved metastasering av brystkreftceller [21]. I andre sammenhenger omdirigerer mitokondriell pyrrolin 5-karboksylatreduktase 1 (PYCR1) overflødig mitokondrielt NADH og/eller glutamat mot prolinsyntese i isocitrat dehydrogenase 1 (IDH1) mutante gliomaceller, noe som fører til en delvis ukoblet TCA-syklus som lar celler regulere mitokondriell NAD + /NADH [22].

Biokjemiske veier og transportører som involverer glutamin (Gln) og beslektede mellomprodukter. Glutamin transporteres av plasmamembrantransportører (f.eks. SLC1A5/ASCT2, SLC6A14/ATB 0,+, SLC38A1/SNAT1, SLC38A2/SNAT2) og drivstoffnukleotid, aminosyre og glykosylsyntese via asparaginsyntetase (ASNS), karbamoylfosfatsyntetase (CPS1), fosforibosylpyrofosfatamidotransferase (PPAT) og glutamin-fruktose 6-fosfataminotransferase (GFPT1). Natrium (Na +) og klorid (Cl −) gradienter over plasmamembranen bestemmer den intracellulære konsentrasjonen av glutamin. Glutamin bidrar direkte med nitrogen for biosyntese av purin og pyrimidin (merket med rødt). Cytosolisk glutamin kan også transportere til mitokondrier via en mitokondriemålrettet (MTS) SLC1A5-variant (MTS-SLC1A5 også referert til som SLC1A5_var) der den fungerer som en viktig anaplerotisk kilde for trikarboksylsyre (TCA) syklusmetabolisme (‘glutaminolyse ) . Glutaminolyse hemmes av BPTES eller CB-839, som spesifikt er rettet mot glutaminase (GLS). Glutamin-avledet glutamat er en betydelig kilde til karbon og nitrogen for ikke-essensiell aminosyresyntese. αKG, α-ketoglutarat Ala, alanine Asp, aspartate CP, carbamoyl fosfat F6P, fruktose 6-fosfat GlcN6P, glukosamin 6-fosfat Gln, glutamin Glu, glutamat Oac, oxaloacetate P5C, pyrroline 5-carboxine phospho-β- d -ribosylamine Pro, proline Pyr, pyruvat.

Selv om evnen til å utnytte glutaminolyseveier er transkripsjonelt iboende i genomet til alle cellene, er tendensen til å shunt glutamin mot dem sannsynligvis vevsspesifikke, celletypespesifikke og avhenger av betingede metabolske behov [23]. For eksempel bruker nyfødte pattedyr prolin, ikke glutamin, som den viktigste anabole innsatsen for argininsyntese [24]. På den annen side er et skifte til glutaminolyse som den viktigste glutamatkilden iboende i mange kreftsammenhenger. Oppregulering av GLS ved onkogene veier er en vanlig mekanisme for dette metabolske skiftet. Den onkogene transkripsjonsfaktoren c-Myc har blitt implisert som en driver for GLS1-oppregulering ved å undertrykke de hemmende effektene på GLS1-oversettelse av miR-23a/b [25]. Denne oppreguleringen av GLS1 gjennom post-transkripsjonelle mekanismer har også blitt tilskrevet andre pro-neoplastiske faktorer. NF-㮫-medlem p65 nedregulerer miR-23a-transkripsjon i leukemiske celler, mens HSF1, som er allestedsnærværende uttrykt i flere krefttyper, undertrykte transkripsjon av GLS1-hemmer miR-137 [26,27]. I tillegg ble transkripsjonsfaktoren c-Jun, en nedstrøms effektor av onkogen-Dbl og JNK-MAP-kinasebanen, vist å direkte binde GLS1-promotoren og fremme oppregulering [28]. I motsetning til GLS1 har GLS2 blitt identifisert som et mål for tumorsuppressoren p53 og kan dermed støtte kreftdempende egenskaper [29,30]. Denne tilsynelatende motsetningen kan være et resultat av forskjeller i egenskaper mellom de to GLS -isozymer og krever ytterligere undersøkelser.

Andre onkogener har videre vist seg å formidle kreftfremkallende effekter gjennom oppregulering av glutaminolyse. I bukspyttkjertelkanalen adenokarsinomceller (PDAC) ble det vist at onkogent KRAS forskyver glutaminmetabolismen ved å oppregulere cytoplasmatisk GOT1 og nedregulere GLUD1, stimulere en vei der glutamin-avledet aspartat fra mitokondriene brukes som en metabolitt for å generere cytosolisk OAA [11]. Påfølgende aktivitet av malat dehydrogenase (MDH) og cytosolisk malisk enzym (ME1) forsyner PDAC -celler med reduserte pyridinnukleotider som er nødvendige for redoks -homeostase [11]. I en egen studie viste PDAC -celler dyrket under sure forhold også en økt avhengighet av glutamin for redokshomeostase og anaplerose [31]. Ved tykktarmskreft (CRC) fører mutasjoner i PIK3CA-genet, som koder for p100 α-underenheten til PI3K, til oppregulering av GPT2 og avhengighet av glutamin-avledede TCA-mellomprodukter for å opprettholde vekst [32]. I tillegg har leverreseptorhomolog 1 (LRH1) blitt implisert som en transkripsjonsfaktor, som driver tumordannelse via effekter på glutaminmetabolisme i hepatocellulært karsinom (HCC) [33]. Totalt sett er oppregulering av glutaminolyse i kreftceller nær allestedsnærværende og oppnås gjennom mange forskjellige onkogene effektorer.

Hemming av avvikende glutaminolyse har i stor grad fokusert på å målrette mitokondriell glutaminaseaktivitet. BPTES og de mer løselige og biotilgjengelige CB-839 hemmer selektivt GLS1 og har blitt undersøkt som antineoplastiske midler i flere sammenhenger [34,35,36,37,38]. Imidlertid viser visse kreftformer (f.eks. Bukspyttkjertel, lunge) motstridende sensitivitet for GLS -inhibering in vitro og in vivo, noe som tyder på at svulster kan være mer glutaminolyseuavhengige in vivo enn modellert i kultur [39,40]. Videre fremhever disse studiene plastiliteten til glutamin- og glutamatmetabolisme og antyder at celler autonomt kan omdirigere metabolsk fluks for å levere glutamat på andre måter (figur 1). Glutamat produseres under syntesen av purin- og pyrimidin-nukleobaser og glykosyleringsunderenheten N-acetyl-glukosamin (GlcNAc). Purin- og pyrimidinsyntese bruker γ-nitrogenet til glutamin for å generere 5-fosfo-β- d -ribosylamin (PRA) og karbamoylfosfat (CP) av fosforibosylpyrofosfatamidotransferase (PPAT) og karbamoylfosfatsyntetase (CPS) domenet til CAD -komplekset, henholdsvis [41,42,43]. Cytosolisk glutamin er også et substrat for glutamin-fruktose 6-fosfataminotransferase (GFPT1), som brukes til å produsere glutamat og glukosamin 6-fosfat (GlcN6P) en forløper for O-koblet N-acetylglukosaminylering [44]. Videre gir cytosolisk asparaginsyntese av asparaginsyntetase (ASNS) også glutamat. Gitt de mange tilførselsveiene for glutamat, har innsatsen for å målrette glutaminbehovet i kreft blitt utvidet for å identifisere antagonister rettet mot mer enn ett glutaminavhengig enzym samtidig. 6-diazo-5-okso-L-norleucin (DON) ble utviklet for flere tiår siden som et potensielt antineoplastisk middel for dets hemmende aktivitet mot mange glutaminavhengige enzymer, inkludert glutaminase og glutaminamidotransferaser [45]. Imidlertid begrenset gastrointestinal (GI) toksisitet hos de fleste pasientene som fikk DON den kliniske bruken [46]. Nylig har pro-medikamentformer av DON blitt utviklet med forbedrede leveringsegenskaper til enten hjernen eller svulster og redusert GI-toksisitet, noe som har stimulert interessen for å bruke glutaminantagonister som antitumormidler [47,48,49,50,51]. En alternativ strategi er å begrense kreftcelletilgang til glutamin ved å hemme transportavhengig opptak. To av de mest veldokumenterte glutamintransportørene er fra SLC1A- og SLC38A -oppløsningsbærerfamiliene (SLC), og de mer promiskuøse Na + /Cl − -avhengige SLC6A14 /ATB 0, + -transportørene kan også spille en rolle i importen av glutamin [ 52,53,54]. SLC1A5/ASCT2-hemmere er identifisert og viser lovende antitumoregenskaper i prekliniske modeller [55,56,57,58,59]. Videre undertrykker målrettet sekundære glutamintransportører (f.eks. SLC38A2, SLC6A14) genetisk eller farmakologisk (f.eks. α-metyltryptofan) aminosyrehomeostase og tumorvekst i kreft i bukspyttkjertelen [60,61].

2.2. Aspartat

Aspartat er en sur ikke-essensiell aminosyre som kan anskaffes ved enten de novo syntese og/eller import fra eksterne kilder. Sirkulasjonsnivået av aspartat under fysiologiske forhold er imidlertid lavt (

10 µM) og opprettholdes av leveraspartat -transaminaser, og derfor gir syntese sannsynligvis størstedelen av cellulær aspartat i de fleste sammenhenger [4]. Biosyntese av aspartat utføres via aspartataminotransferaser (glutamisk-oksaloacetiske transaminaser) i cytosolen (GOT1) og i den mitokondrielle matrisen (GOT2), som som diskutert ovenfor bruker glutamat som amino-nitrogenkilden. Aspartat har mange biosyntetiske skjebner i cellen (f.eks. Proteiner, nukleotider og aminosyrer) og fungerer også som en utvekslingsfaktor for aspartat-glutamatbæreren (AGC1/AGC2), en vesentlig komponent i malat-aspartat-shuttle (MAS ) (Figur 2). MAS er ansvarlig for å overføre elektroner fra cytosolisk NADH til mitokondrielt NADH, ettersom reduserende ekvivalenter (f.eks. NAD (P) H) ikke kan krysse den indre mitokondriemembranen direkte. Nyere studier identifiserte imidlertid at SLC25A51 og SLC25A52 letter mitokondriell NAD + -transport [62,63,64]. Påfølgende aktivitet av MAS og/eller UCP2 er nødvendig for å eksportere aspartat til cytosolen hvor det kan brukes som en proteinogen kilde og/eller en forløper for arginin og asparaginsyntese [65,66].

Biokjemiske veier og transportører som involverer aspartat (Asp) og beslektede mellomprodukter. Aspartat transporteres av plasmamembrantransportøren SLC1A3, som også transporterer glutamat. Aspartat syntetiseres av glutamic-oxaloacetic transaminases (GOT) tilstede i cytosol (GOT1) eller mitokondrier (GOT2). Mitokondriell utstrømning av aspartat skjer hovedsakelig gjennom SLC25A12 eller SLC25A13, som motveksler glutamat og er kritiske komponenter i malat-aspartat-shuttle (MAS) og UCP2. Cytosolisk aspartat brukes som et substrat for asparagin- og argininsyntese via asparaginsyntetase (ASNS) og argininosuccinatsyntase (ASS1) og som et substrat for nukleotidbiosyntese, som bidrar med karbon og nitrogen til purin og pyrimidiner (markert med rødt). Cytosolisk asparagin brukes som utvekslingsfaktor for flere aminosyrer gjennom en ukjent plasmamembrantransportør. AA, aminosyre AcCoA, acetyl-koenzym A αKG, α-ketoglutarat Asn, asparagin Asp, aspartat FH, fumarathydratase Gln, glutamin Glu, glutamat GSH, redusert glutation GSSG, oksidert glutation, malat , pyruvat SDH, succinat dehydrogenase UCP2, kobling av protein 2.

I mange sammenhenger syntetiseres aspartat hovedsakelig av mitokondrielt GOT2 og antydes å være en utgang fra mitokondriell elektrontransportkjede (ETC) aktivitet i prolifererende celler [11,67,68,69,70,71,72]. Selv om ATP er en annen viktig effekt av ETC -aktivitet, kan prolifererende celler med tilstrekkelig tilgang til glukose bytte til aerob glykolyse for i stor grad å tilfredsstille disse kravene [67]. Aspartat har en biosyntetisk rolle og fungerer som en nitrogendonor for adeninsyntese og et karbonryggrad via orotat for pyrimidinsyntese. Tilgjengeligheten av aspartat har blitt antydet å være begrensende for spredning av visse kreftformer. Sullivan et al. benyttet en marsvin-asparaginase (gpASNase1) for å forsyne svulster med asparagin-avledet aspartat og observerte forbedret tumorvekst i henholdsvis HCT116 og AL1376 kolorektale og murine PDAC-cellelinjer [73]. Interessant nok hadde gpASNas1 liten eller ingen effekt på den menneskelige AsPC1 -tumorveksten. På samme måte bruker noen kreftceller et plasmamembranglutamat og aspartattransportør, SLC1A3, for å tilveiebringe aspartat under forhold der de novo -syntese er begrenset av ETC -hemming [74]. Miljøinnsamling av aspartat av SLC1A3 har også vært implisert i hypoksiske mikromiljøer eller som svar på glutaminbegrensning [72,74,75]. Hypoksi undertrykker angivelig mitokondriell aspartatbiosyntese via HIF1 α-avhengig nedregulering av GOT1 og GOT2 i Von Hippel-Lindau (VHL) -defekte nyrekarsinomceller [76]. Imidlertid har kreft i bukspyttkjertelen vist seg å opprettholde biosyntetiske aspartatflukser i oksygenspenninger så lave som 0,1% O2 gjennom aktivitet av kompleks III+IV som inneholder respiratoriske superkomplekser, som foreslås å fremme effektiv respirasjon i begrensende oksygenmiljøer [77]. Spesielt skjer maksimal HIF -stabilisering i

1% O2, godt over spenninger der oksygen blir begrensende for mitokondriell respirasjon [78]. Selv om glutaminolyse gir cellene det meste av karbon som er nødvendig for å syntetisere aspartat, i kreftundertyper drevet av TCA-syklusmangler (f.eks. SDH- eller FH-mangel), kan pyruvatkarboksylaseaktivitet avlede glukoseavledet pyruvat for å forsyne oxaloacetat som er nødvendig for denne anabole funksjonen [79,80,81,82,83,84]. Dette skiftet til PC-avhengig aspartatsyntese ble også observert i PDAC-svulster in vivo og i bryst- og lungekreftcellelinjer utsatt for hypoksiske oksygenspenninger [77,85]. Til sammen er aspartat en kritisk anabol metabolitt som er nødvendig for å levere nukleotider for prolifererende kreftceller, men syntesen fra glutamin- og/eller glukoseavledede veier er kompleks og sterkt avhengig av miljøkonteksten og tilgjengeligheten av næringsstoffer.

Cytosolisk aspartat brukes av ASNS og ASS1 for henholdsvis asparagin- og argininbiosyntese (figur 2). Produksjonen av disse aminosyrene støtter proteinoversettelse, men spiller også indirekte roller for spredning. For eksempel fungerer asparagin som en aminosyreutvekslingsfaktor for å lette tilstrømningen av andre aminosyrer (f.eks. Serin, treonin) som er nødvendig for å regulere pattedyrmål for rapamycinkompleks 1 (mTORC1) aktivitet og spredning [86]. Arginin er en viktig kilde til cellulært nitrogenoksid (NO), gjennom aktivitet av iNOS, eller blir katabolisert av arginase som det siste trinnet i ureasyklusen. Arginin og andre grunnleggende aminosyrer (f.eks. Lysin, ornitin) kan også transportere inn i mitokondriene ved SLC25A29 [87].Ekspresjon av SLC25A29 ble vist å være forhøyet i flere kreftcellelinjer og viktig for NO -produksjon av et mitokondrielt NOS [88]. Aktiviteten til ekstrahepatisk arginase 2 (ARG2) regulerer også mitokondriell NO -produksjon [87,89,90]. Spesielt nedregulerer flere kreftformer aktiviteten til disse veiene ved å dempe ASS1- og/eller ASNS-uttrykk, noe som skaper en avhengighet (auxotrofi) for miljømessig og/eller stromal oppkjøp av disse aminosyrene [91,92,93,94]. Demping av ASS1 og/eller ASNS kan gi en selektiv fordel for kreftceller, noe som muliggjør avledning av aspartat mot andre anabole veier som nukleotidbiosyntese. Viktigere er at aktiviteten til MAS og/eller andre mitokondrielle aspartattransportører (f.eks. UCP2) representerer et sentralt trinn for å regulere romtilgjengelighet av denne kritiske aminosyren [65,66].

2.3. Serine, Glycine og Alanine

Metabolismen av små nøytrale aminosyrer serin, glycin og alanin forekommer i både cytosol og mitokondrier og har implikasjoner for fysiologi og menneskelige sykdommer (figur 3). Serin består av en enkel hydroksymetyl sidekjede og blir enten tatt opp eller syntetisert de novo fra det glykolytiske mellomproduktet 3-fosfoglyserat av tre cytosoliske enzymer, fosfoglyserat dehydrogenase (PHGDH), fosfoserin aminotransferase (PSAT1) og fosfoserinfosfatase (PSPH). Serinsynteses aktivitet er viktig for normal utvikling, som sletting av Phgdh forårsaker embryonal dødelighet delvis på grunn av nevrologiske defekter [95]. Serin, spesielt D-serin, antas å være en kritisk eksitatorisk nevrotransmitter som fungerer som en co-agonist av N-metyl D-aspartat (NMDA) -reseptoren på nevroner, og uttømming på grunn av mangelfull syntese eller racemase-aktivitet sannsynligvis fører til katastrofal nevrotoksisitet [96]. Unormale D-serinnivåer i hjernen antas å bidra til nevrodegenerative lidelser som Alzheimers sykdom og schizofreni [97,98,99,100]. Uttrykk av serinbiosynteseenzymer er sterkt regulert av flere faktorer, inkludert NRF2-ATF4 [101,102], c-Myc [103] og hypoksi-induserbare faktorer [104]. Mange av disse transkripsjonelle regulatorene er endret i kreft og bidrar til økt serinsyntesefluks, men PHGDH -ekspresjon ble også forsterket gjennom kopitallforsterkning av en genomisk region på kromosom 1p12 i en undergruppe av bryst og melanom [105,106]. PHGDH -ekspresjon har vist seg å støtte tumorvekst spesielt i lave serinmiljøer, for eksempel cerebrospinalvæske hvor konsentrasjonene er betydelig lavere enn plasma, og diettbegrensning av serin og glycin reduserer tumorvekst i prekliniske kreftmodeller og forbedrer aktiviteten til mitokondrielle hemmere [107,108,109,110,111] . Videre har en undergruppe av PDAC -celler nedregulert serinsynteseenzymer, og nevronforsyning har vist seg å gi kreftceller serin spesielt i nullmiljøer [112]. Siden PHGDH antas å være det hastighetsbegrensende trinnet for serinesyntese og viktig for spredning av PHGDH-forsterkede kreftcellelinjer, har flere hemmere blitt utviklet [113,114,115]. Spesielt kan serinesyntese og opptak skje parallelt med katabolisme, avhengig av kontekst og cellebehov for serin og/eller dens mange kataboliske utganger.

Metabolisme av små, nøytrale aminosyrer inkludert serin (Ser), glycin (Gly) og alanin (Ala). Serin, glycin og alanin transporteres hovedsakelig av plasmamembrantransportørene SLC38A1, SLC38A2, SLC1A4 og SLC1A5 eller syntetiseres de novo ved cytosoliske og/eller mitokondriale veier. Natrium (Na +) gradienter på tvers av plasmamembranen driver intracellulær konsentrasjon av serin, glycin og alanin. Serin syntetiseres fra 3-fosfoglyserat (3pg) gjennom en tretrinnsprosess som involverer 3-fosfoglyserat dehydrogenase (PHGDH), fosfoserinaminotransferase (PSAT1) og fosfosereinfosfatase (PSPH). Cytosolisk serin brukes til flere metabolske veier, inkludert transsulfurasjonsveien for de novo cysteinsyntese og folat-mediert ett karbonmetabolisme (FOCM) som involverer serinhydroksymetyltransferase (SHMT) og metylentetrahydrofolat dehydrogenaser (MTHFD). FOCM forekommer i både cytosol og mitokondrier og kan produsere glycin. I cytosolen brukes glycin til glutation -syntese og purinsyntese (markert med rødt) og fungerer som et substrat for metioninsyklusen som er viktig for metyleringsreaksjoner. I mitokondriene kan glycin spaltes av glycin-spaltningssystemet (GCS) for å gi ett karbon forenes for FOCM og er et substrat for syntese av x003b4-aminolevulinsyre (δ-ALA). Når GCS -aktiviteten er lav, kan mitokondriell glycin føre til akkumulering av metylglyoksal. Komponenter av FOCM, inkludert 5,10-metylen-tetrahydrofolat (5,10-meTHF) og 10-formyl-tetrahydrofolat (10-formylTHF) kan bidra til nukleotidbiosyntese (markert med henholdsvis mørkeblå og mørkerød). Mitokondriell serinimport blir lettere av siderofleksin 1 og 3 (SFXN1/3), formiat transporteres med en ukjent transportmekanisme (er), og glycin importeres av SLC25A38 og andre transportører kan være involvert. Alanin syntetiseres fra pyruvat av cytosoliske eller mitokondriale glutamisk-pyruviske transaminaser (GPT) lokalisert til cytosol (GPT1) eller mitokondrier (GPT2). Pyruvat importeres til mitokondriene av mitokondriell pyruvatbærer (MPC1/2), en obligatorisk heterodimer. Alanin utveksles mellom cytosol og mitokondrier av en ukjent transportør. 10-formylTHF, 10-formyl-tetrahydrofolat 3pg, 3-fosfoglyserat 5,10-meeTHF, 5,10-metenyl-tetrahydrofolat 5,10-meTHF, 5,10-metylentetrahydrofolat 5-mTHF, 5-metyl-tetrahydrofolat akkoa , acetyl-koenzym A αKG, α-ketoglutarat Ala, alanine Cys, cystein δ-ALA, δ-aminolevulinsyre DMG, dimetylglycin Gap, glyseraldehyd 3-fosfatglukose glutation Homocys, homocystein Lac, lactate Met, methionine Oac, oxaloacetate p-Pyr, 3-phosphopyruvat p-Ser, phosphoserine Pyr, pyruvat SAH, S-adenosylhomocystein SAM, S-adenosylmethionine Ser, serine Succ-coa, succinyl-coen , tetrahydrofolat.

Serin brukes til glysyntese så vel som til ceramid- og sfingolipidsyntese, nukleotidsyntese, folat-mediert ett-karbonmetabolisme (FOCM), S-adenosylmetionin-regenerering for metyleringsreaksjoner og transsulfurasjon for cysteinbiosyntese (figur 3). Glycin syntese krever at de cytosoliske og mitokondrielle enzymene serin hydroksymetyltransferase (SHMT1/2) produserer ett-karbon enheter i form av 5,10-metylen-tetrahydrofolat (5,10-meTHF). Påfølgende aktivitet av metylentetrahydrofolat dehydrogenaser (MTHFD1/1L/2) frigjør formiat, som kan transporteres over mitokondriemembraner. Den resulterende metabolske syklusen fungerer som en shuttle for NAD (P) H reduserende ekvivalenter og ett-karbon enheter som kreves for tymidin og purinsyntese. Retningen av FOCM-metabolske syklus fungerer hovedsakelig oksidativt i mitokondriene, men kan reversere for å opprettholde en-karbonforsyning for nukleotidsyntese i tilfeller der mitokondrielle isoformer blir slettet [116,117,118]. Høy aktivitet og avhengighet av SHMT1/2 for spredning har blitt påvist i flere kreftsammenhenger, og hemmere rettet mot disse enzymene er utviklet [105,106,119,120]. I fulle miljøer kan serinkatabolisme av SHMT2 forekomme i overskudd og frigjøring av glycin og formiat, betegnet 𠇏ormate overflow ”, har blitt rapportert for flere kreft- og ikke-transformerte cellelinjer og hos mus [121]. Gjennom denne mekanismen fungerer serinkatabolisme som en signifikant kilde til både ATP og NAD (P) H, og fluks gjennom denne banen ble demonstrert for å støtte oksidativ mitokondriell metabolisme [122]. Som svar på farmakologisk inhibering av respirasjon som forventes å øke mitokondrielt NADH/NAD +, opprettholdes mitokondriell serinkatabolisme, mens andre enzymatiske NADH -kilder (f.eks. Pyruvatdehydrogenase) ble tilbakemeldingshemmet [123]. Dermed er serinmetabolismen svært kompleks og kan gi cellene glycin, ett-karbon-enheter, NAD (P) H og ATP avhengig av kontekst og mobilbehov [124].

Glycin kan også bidra med en-karbon-enheter gjennom mitokondriell aktivitet av glycin-spaltningssystemet (GCS), som frigjør CO2, NH3og 5,10-meTHF (figur 3). Spesielt ble aktiviteten til GCS i mange kreftcellelinjer funnet å være lav i forhold til serinkatabolisme [125]. I forbindelse med kreftcellelinjer med høy mitokondriell SHMT2-fluss er imidlertid GCS-aktivitet nødvendig for å fjerne overflødig glycin og forhindre oppbygging av de giftige biproduktene aminoaceton og metylglyoksal avledet fra interkonvertering av glycin og treonin [126]. Det ble funnet at metylglyoksal akkumuleres i ikke-småcellet lungekreft i forhold til normalt vev, og sekvestrering av giftig metylglyoksal krever glutation (GSH) og aktivitet av glyoksalase (GLO1) for å forhindre celleskade [127]. GCS -aktivitet har vist seg å være viktig for å opprettholde pluripotens av stamceller gjennom epigenetisk regulering [128]. Ekstracellulær glycin kan også brukes for SHMT-avhengig serinsyntese, men krever en eksogen kilde til formiat [125]. I tillegg til FOCM er glycin også en forløper som er nødvendig for syntesen av GSH og δ-aminolevulinsyre (δ-ALA mitokondriell) nødvendig for hembiosyntese. Syntese av glutation forekommer i cytosolen, noe som krever mitokondriell eksport av glycin og GSH -import til intracellulære organeller inkludert mitokondriene, som inneholder

10% av cellulær GSH ved en lignende konsentrasjon som cytosolen [129]. Vedlikehold av GSH-bassenger er viktig for å regulere aktiviteten til proteiner som er følsomme for post-translasjonell oksidasjon av cysteinrester (f.eks. PTP1B) [130,131,132]. Innsikt i aktiviteten og nedstrøms rolle for serin- og glycinmetabolisme kan oppnås ved undersøkelse av ekstracellulært opptak og sekresjon, men cytosolisk-mitokondriell utveksling er like viktig og krever en rekke plasmamembraner og mitokondrielle transportører [121,133].

Alaninsyntese krever cytosoliske og/eller mitokondriale glutamisk-pyruviske transaminaser (GPT1/2). Fysiologisk syntese skjer i skjelettmuskulatur fra henholdsvis pyruvat og glutamat avledet fra henholdsvis glykolyse og BCAA -katabolisme. Alanin som skilles ut av muskler gir karbonet som er nødvendig for glukoneogenese i leveren, som igjen gir glukose tilbake til musklene og sekvestrerer nitrogenet som produseres fra alaninkatabolisme som urea [134,135,136,137]. Den resulterende glukose/alaninsyklusen, referert til som �hill syklusen ”, er en viktig organkryssing relevant under normal fysiologi, trening, faste og sykdom [138]. Dysregulering av denne syklusen er foreslått å forekomme hos kreftpasienter, hvorved økt proteinomsetning og/eller muskelnedbrytning (�hexia ”) frigjør alanin, BCAA og andre aminosyrer for hepatisk glukoneogenese [139,140,141]. Forhøyet lever-alanin-til-glukose-konvertering ble målt hos lunge- og andre kreftpasienter, men plasma-alaninnivåer forble stort sett stabile [142,143,144,145]. Hepatocytter uttrykker både cytosoliske (GPT1) og mitokondrielle (GPT2) isoformer som kreves for de novo alaninsyntese og katabolisme. Imidlertid tyder biokjemiske parametere og studier på at GPT1 (Km, ala = 34 mM) og GPT2 (Km, ala = 2 mM) viser preferanse for henholdsvis alaninanabolisme og katabolisme, selv om dette var sterkt avhengig av metoden som ble brukt for å fastslå retningsbestemmelse [ 146,147,148,149,150]. Nyere bevis tyder på at kreftceller i bukspyttkjertelen har stor etterspørsel etter alanin og fjerner alanin fra stromale kilder (f.eks. Aktiverte stellatceller) [60,151]. Flertallet av humane kreftceller i bukspyttkjertelen uttrykker selektivt GPT2, både på transkripsjon og proteinnivå, noe som tyder på at alaninmetabolisme hovedsakelig forekommer i mitokondriene [60]. Spesielt krever mitokondriell alaninkatabolisme av GPT2 aktivitet av en mitokondriell alanintransportør, som ble funksjonelt identifisert for flere tiår siden, men fortsatt er ukjent [147]. Lavt uttrykk for cytosolisk GPT1, som katalyserte alaninsyntese fra pyruvat i hepatocytter, og alaninopptak ble foreslått for å gi kreftceller i bukspyttkjertelen kapasitet til å beholde pyruvat i cytosolen og støtte aerob glykolyse [60,152]. I motsetning krever na ïve T -lymfocytter alanin for aktivering ettersom verken GPT1 eller GPT2 uttrykkes på tilstrekkelige nivåer [153]. Alaninproduksjon fra pyruvat ble funnet å være viktig for metastasering av brystkreftceller, noe som gir en kilde til x003b1-ketoglutarat som brukes til kollagenhydroksylering og ekstracellulær matrise (ECM) ombygging [154]. Viktigere er det blitt antydet at transport over plasmamembranen kan være det viktigste hastighetsbegrensende trinnet for alaninmetabolisme ved ekstracellulære konsentrasjoner ρ mM [147,155,156]. Normale plasmanivåer av alanin er

0.2 𠄰.4 mM, men forhøyede nivåer (

1 mM) er målt intratumoralt, noe som tyder på endret alaninmetabolisme og tilgjengelighet i kreft og tumorassosierte stromaceller [157,158]. Spesielt ble SLC38A2/SNAT2 identifisert som den viktigste konsentrative alanintransportøren som ble brukt av kreftceller i bukspyttkjertelen, og målrettet mot SLC38A2 var tilstrekkelig til å undertrykke opptak av alanin av kreftceller i bukspyttkjertelen og forårsake betydelig omkobling av pyruvatmetabolisme i seksjoner [60]. Til sammen tyder disse studiene på at forstyrrende alaninmetabolisme i kreft er mulig ved å endre plasmamembrantransport, og mitokondriell alanintransport kan være en sentral aktør i glukose-pyruvat-alaninmetabolisme av skjelettmuskulatur, hepatocytter og kreftceller.

2.4. Forgrenede aminosyrer

Grenede aminosyrer (BCAA) inkluderer leucin, isoleucin og valin og er avledet fra kostholdskilder. På grunn av deres essensialitet hos pattedyr har BCAA -transport og sansing i tillegg til katabolske oppkjøpsmekanismer (f.eks. Autofagi, makropinocytose) tiltrukket seg stor interesse. Mobilopptak av BCAA lettes hovedsakelig av aminosyretransportøren av L-typen (SLC7A5/LAT1), som krever dimerisering med SLC3A2/CD98 for å fungere. Den transporterer også aromatiske aminosyrer (f.eks. Tyrosin, fenylalanin) (figur 4) [159,160]. Spesielt er LAT1 natriumuavhengig og er avhengig av at andre aminosyrer fungerer som utvekslingsfaktorer for å lette netto BCAA-import [159]. Leucin er godt karakterisert for å påvirke mTORC1 -signalering, som er avvikende aktivert på tvers av mange krefttyper [161]. Leucine kan aktivere mTORC1-signalering gjennom direkte sensing av Sestrin2 og forstyrrelse av Sestrin2-Gator2-interaksjonen, og utløse en signalkaskade gjennom nedstrøms effektorer (f.eks. Eukaryotisk translasjonsinitieringsfaktor 4E-bindende protein 1, p70-S6 kinase, ULK1) [161,162,163,164]. Disse signalene koordinerer spredning gjennom aktivitet av autofagi og protein, lipid og nukleotidsyntese.

Biokjemiske veier og sansemekanismer som involverer forgrenede aminosyrer (BCAA) leucin (Leu), isoleucin (Ile) og valin (Val). BCAA importeres hovedsakelig av den store aminosyretransportøren (LAT1), en dimer bestående av SLC7A5 og SLC3A2/CD98, som fungerer som en aminosyreveksler og Na + -avhengig SLC16A9/B0AT1. Glutamin — hovedsakelig transportert av SLC38A1, SLC38A2 og SLC1A5 — antas å gi den kjemiske drivkraften som er nødvendig for å strømme BCAA gjennom LAT1. Cytosolisk leucin registreres direkte av Sestrin2 og regulerer mTORC1-avhengige signaler som styrer autofagi, proteinsyntese og spredning. BCAA kan metaboliseres av BCAA transaminase (BCAT) som er tilstede i cytosol (BCAT1) eller mitokondriell (BCAT2), som produserer forgrenede ketoacider (BCKA). Cytosoliske BCKA kan transporteres gjennom SLC16A monokarboksylat transportører tilstede på plasmamembranen eller mitokondrier. BCAA importeres til mitokondriene av SLC25A44 og kan bidra til acyl -CoA -produksjon gjennom aktivitet av BCAT2 og BCKA dehydrogenase (BCKDH), som er regulert av BCKDH kinase (BCKDK) og Mg 2+ /Mn 2+ -avhengig 1K proteinfosfatase ( PPM1K). Acyl-CoA produsert av BCAA-katabolisme kan drive TCA-syklusmetabolisme og de novo lipogenese. Acetyl-CoA-nivåer registreres gjennom EPS300-avhengig acetylering av RAPTOR, som igjen regulerer mTORC1-aktivitet. Mitokondrielt propionyl-CoA, produsert enten fra valin- eller isoleucinkatabolisme, metaboliseres for å produsere succinyl-CoA, men kan produsere biproduktet metylmalonat (MMA) når vitamin B12-nivåer er lave. AcCoA, acetyl-koenzym A αKG, α-ketoglutarat Gln, glutamine Glu, glutamate Ile, isoleucine KIC, α-ketoisocaproic acid KIV, α-ketoisovaleric KMV,    -metylvaleric Leu, leucine Oac, oxaloacetate PropCoA, propionyl-koenzym A SucCoA, succinyl-coenzym A Val, valine.

På grunn av det store uttrykket for SLC1A5/ASCT2 og LAT1, har det blitt antydet at ASCT2-avhengig glutaminopptak kan tjene som utvekslingsfaktor for BCAA-tilstrømning av LAT1. ASCT2 er imidlertid tilgjengelig for spredning og mTORC1 -signalering i mange kreftlinjer, og ASCT2 fungerer først og fremst som en veksler som ikke klarer å konsentrere glutamin tilstrekkelig til å drive LAT1 -aktivitet [55,165,166]. Dermed er sekundære aktive glutamintransportører (f.eks. SNAT1/SLC38A1, SNAT2/SLC38A2, SLC6A14/ATB 0,+) mer sannsynlig å bidra til glutaminkonsentrasjon for LAT1-mediert utveksling. Sletning av SLC38A2 ved kreft i bukspyttkjertelen påvirket imidlertid ikke BCAA- eller glutaminopptakstrømmen til tross for betydelig reduserte intracellulære glutaminnivåer [60]. Snarere kan transportsamarbeid mellom glutamin- og BCAA -transportører være viktigere for nivåvedlikehold. Faktisk resulterer LAT1 knockout i

90% reduksjon i leucintransport i hepatocellulære karsinomceller, men unnlater ulovlige proliferative defekter, og knockdown eller inhibering av LAT1 påvirket ikke mTORC1-reaktivering negativt etter EAA-stimulering [165,167]. Videre ble knockout av SLC3A2/CD98 avskaffet

90% av leucinopptaket av LAT1 i kolonadenokarsinomceller, men proliferative defekter og aktivering av GCN2-koblet aminosyrestressrespons ble ikke observert [168]. Plasmamembran transport av BCAA og/eller glutamin kan derfor ikke være begrensende eller er sterkt avhengig av den cellulære konteksten, og minimal transportkapasitet kan være tilstrekkelig for å tilfredsstille de biosyntetiske og katabolske kravene til disse aminosyrene. I kontrast ble LAT1 betydelig oppregulert i en Apc fl /fl LSL-Kras G12D /+ Villin CreER musemodell for tykktarmskreft, og målrettet sletting av Slc7a5 resulterte i forsinket tumorigenese og forbedret overlevelse [169]. Videre har JPH203, en liten molekylhemmer av LAT1, vist signifikant preklinisk effekt ved tykktarmskreft og T-celle lymfoblastisk lymfom/leukemi og ble godt tolerert i en fase I-studie hos pasienter med avanserte solide tumorer [170,171,172]. Andre transportsystemer kan lette BCAA-opptak, inkludert Na+-avhengig SLC6A19/B0AT1, noe som kan bidra til ulik følsomhet som respons på LAT1-sletting [173,174]. Inhibitorer rettet mot SLC6A19/B0AT1 har blitt utviklet ved bruk av siliko- og høykapasitetsscreeningsmetoder [175,176].

Bortsett fra å bli brukt til proteinsyntese, kan BCAA bidra til anabole og bioenergiske utganger som er viktige for menneskelig fysiologi, og dysregulert aktivitet tilskrives flere sykdommer (omtalt i [161,177,178]) (figur 4). Gjennom katalytisk aktivitet av meget reversible forgrenede aminotransferaser (BCAT1/2) lokalisert i cytosol (BCAT1) eller mitokondriell matrise (BCAT2), gir BCAA-katabolisme celler med aminot nitrogen for glutamatsyntese så vel som forgrenede ketosyrer (BCKA) (f.eks. , α-ketoisocaproic, KIC α-ketoisovaleric, KIV α-keto-β-methylvaleric, KMV) som bidrar til acyl-CoA-syntese, lipogenese og TCA-syklusmetabolisme. Mens BCAT2 er allestedsnærværende uttrykt, uttrykkes BCAT1 selektivt i hjernen, eggstokken og morkaken [179]. BCAT1 er vanligvis oppregulert i mange forskjellige kreftlinjer, for eksempel humant glioblastom, brystkreft og ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC), mens BCAT2 virker viktigere for kreft i bukspyttkjertelen [180]. Videre er forhøyede plasma -BCAA -nivåer assosiert med flere sykdommer, inkludert kardiovaskulær sykdom, kreft i bukspyttkjertelen og brystkreft [139,181,182]. I mitokondriene kan BCKA gjennomgå irreversibel dekarboksylering av forgrenet α-ketoacid dehydrogenase (BCKDH) kompleks, som består av tre underenheter (E1, E2 og E3). Aktiviteten til BCKDH er negativt regulert av fosforyleringsstatusen til E1 -underenheten. BCKDH kinase (BCKDK) og Mg 2+ /Mn 2+ -avhengig 1 K proteinfosfatase (PPM1K) koordinerer aktiviteten til BCKA -oksidasjon. Aktivitet av PPM1K ble vist å positivt regulere BCAA -katabolisme som er viktig for leukemogenese [177,183]. Videre driver defekt BCKA -oksidasjon den medfødte feilen ved metabolisme lønnesirup urinsykdom (MSUD), og dysregulert BCKDH -aktivitet tilskrives også flere menneskelige sykdommer (f.eks. Diabetes, kreft) [184].

Acyl-CoA-produkter av BCAA-oksidasjon (f.eks. Acetyl-CoA, propionyl-CoA, succinyl-CoA) har potensial til å bidra med karbon for oksidativ TCA-syklusaktivitet og/eller lipogenese, noe som tyder på at BCAA kan tjene som en viktig drivstoffkilde for proliferativ celler. I tillegg kan acetyl-CoA avledet fra leucin gi direkte proliferative signaler gjennom acetylering av Raptor via EP300, som igjen regulerer autofagosomdannelse negativt og aktiverer mTORC1-signalering [185,186]. Hvorvidt dette representerer et stort metabolsk bidrag, spesielt til TCA -syklusen, avhenger sterkt av konteksten. Det metabolske bidraget til BCAA-avledet acyl-CoA har blitt omfattende karakterisert i mutante Kras-drevne svulster (f.eks. Bukspyttkjertel, lunge) gitt sammenhengen mellom forhøyede plasmanivåer og sykdomsprogresjon [139]. Ved akutt myeloid leukemi (AML), kreft i bukspyttkjertelen og kreftceller i tykktarm og tykktarm, samt i LSL-Kras G12D /+ TRP53 flox /flox -drevne lunge- og bukspyttkjertelsvulster, bidro 13 C-merkede BCAAer minimalt til mitokondrielle TCA-syklusmellomprodukter uavhengig av hvilken BCAT1/2-isoform som uttrykkes i hver kontekst [180,187,188,189,190]. I kontrast viste kreftassosierte fibroblaster avledet fra humane bukspyttkjertelsvulster høyere BCAA-oksidasjonsfluks enn kreftceller i bukspyttkjertelen, og BCKAs utskilt fra CAF ble inkorporert i TCA-syklusen i humane kreftceller i bukspyttkjertelen gjennom påfølgende oksidasjon [191]. På samme måte ble det vist at 13 C-KIC, avledet fra leucinkatabolisme, ble oksidert av svulster i en rottegliommodell ved bruk av hyperpolarisert kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi [192]. Transport av BCKA over plasmamembranen lettes hovedsakelig av monokarboksylat -transportører, MCT1/SLC16A1 og MCT4/SLC16A4, slik at celler kan dele bassenger med sirkulerende BCKA -er som kan omdannes til BCAA -er om nødvendig [193,194,195,196]. I adipocytter representerer BCAA en viktig anaplerotisk og lipogen kilde. Acetyl-CoA eller propionyl-CoA brukes til fettsyresyntese med like eller ulik kjede, og i tillegg til succinyl-CoA bidrar det betydelig til TCA-syklusmellomprodukter (f.eks. Sitrat) [197,198,199]. Fettvev kan også utnytte BCAA-katabolisme for å generere mono-metylerte forgrenede fettsyrer gjennom promiskuøs aktivitet av karnitinacetyltransferase (CRAT) og fettsyresyntase (FASN) [200]. Spesielt er metylmalonyl-CoA-mutasen som kreves for å konvertere propionyl-CoA til succinyl-CoA B12-avhengig, og oddskjede fettsyrer og metylmalonsyre (MMA) akkumuleres i adipocytter bare når de dyrkes i medier som mangler kobalamin (f.eks. DMEM) [199]. I en nylig studie korrelerer økte MMA-nivåer i sirkulasjon med økende alder, og MMA ble funnet å fremme en epitel-mesenkymal overgang (EMT) -lignende fenotype og bidra til økt tumorigenese [201].


Biogenese av porin i den ytre mitokondriemembranen innebærer en importvei via reseptorer og den generelle importporen til TOM -komplekset

Porin, også kalt den spenningsavhengige anionkanalen, er det mest forekommende proteinet i den mitokondriale ytre membranen. Prosessen med import og montering av proteinet er kjent for å være avhengig av overflatereseptoren Tom20, men kravet til andre mitokondrielle proteiner er fortsatt kontroversielt. Vi har brukt mitokondrier fra Neurospora crassa og Saccharomyces cerevisiae for å analysere importveien til porin. Import av porin til isolerte mitokondrier der den ytre membranen er åpnet, er hemmet til tross for lignende nivåer av Tom20 som i intakte mitokondrier. En matrisebestemt forløper og porinforløperen konkurrerer om de samme translokasjonsstedene i både normale mitokondrier og mitokondrier hvis overflatereseptorer er fjernet, noe som tyder på at begge forløperne bruker den generelle importporen. Ved å bruke en analyse som er etablert for å overvåke montering av in vitro-importert porin i eksisterende porinkomplekser, har vi vist at i tillegg til Tom20 er biogenesen av porin avhengig av den sentrale reseptoren Tom22, så vel som Tom5 og Tom7 i det generelle importporekomplekset (translokase av den ytre mitokondriemembranen [TOM] kjernekompleks). Karakteriseringen av to nye mutante alleler av det essensielle poreproteinet Tom40 viser at import av porin også krever en funksjonell Tom40. Videre kan porinforløperen krysskobles til Tom20, Tom22 og Tom40 på importveien. Vi konkluderer med at import av porin ikke går gjennom virkningen av Tom20 alene, men krever en intakt ytre membran og involverer minst fire andre underenheter av TOM -maskiner, inkludert den generelle importporen.

Figurer

Import av F 1 β og porin inn N . crassa mitokondrier med ...

Montering av in vitro -importert porin ...

Montering av in vitro -importert porin i eksisterende komplekser. (A) radiomerket forløper til gjær ...

Innsetting av porin er hemmet ...

Innsetting av porin hemmes ved å blokkere translokasjonsporen med importmellomprodukter.…

Porin danner høy molekylvekt ...

Porin danner komplekser med høy molekylvekt i gjær. (A) renset S . cerevisiae ...

Import av porin krever komponenter ...

Import av porin krever komponenter i GIP. (A) Nivåer av Tom -proteiner ...

Import av porin påvirkes ikke i tom40-3 mutant mitokondrier. (A) Eksperimentet ...

To nye mutante alleler av ...

To nye mutante alleler av TOM40 . (A) Forutsagte aminosyresekvenser (enkelt ...

Porin er i nærheten av Tom20, Tom22 og Tom40 ved innsetting ...

Import av porin er hemmet ...

Import av porin er hemmet tom40 mutant mitokondrier. (A) radiomerket porinforløper ...


Innhold

Aspartattransaminase katalyserer interkonvertering av aspartat og α-ketoglutarat til oksaloacetat og glutamat.

L-aspartat (Asp) + α-ketoglutarat, oksaloacetat + L-glutamat (Glu)

Som en prototypisk transaminase er AST avhengig av PLP (vitamin B6) som en kofaktor for å overføre aminogruppen fra aspartat eller glutamat til den tilsvarende ketosyren. I prosessen skifter kofaktoren mellom PLP og pyridoksaminfosfatet (PMP). [6] Aminogruppeoverføringen katalysert av dette enzymet er avgjørende for både nedbrytning av aminosyrer og biosyntese. Ved nedbrytning av aminosyrer, etter omdannelsen av α-ketoglutarat til glutamat, gjennomgår glutamat deretter oksidativ deaminering for å danne ammoniumioner, som skilles ut som urea. I omvendt reaksjon kan aspartat syntetiseres fra oksaloacetat, som er et sentralt mellomprodukt i sitronsyresyklusen. [7]

To isoenzymer er tilstede i en rekke eukaryoter. Hos mennesker:

Disse isoenzymer antas å ha utviklet seg fra en felles forfedre AST via gentuplisering, og de deler en sekvenshomologi på omtrent 45%. [8]

AST er også funnet i en rekke mikroorganismer, inkludert E coli, H. mediterranei, [9] og T. thermophilus. [10] I E coli, enzymet er kodet av aspCgenet og har også vist seg å vise aktiviteten til en aromatisk-aminosyretransaminase (EC 2.6.1.57). [11]

Røntgenkrystallografistudier er utført for å bestemme strukturen til aspartattransaminase fra forskjellige kilder, inkludert kyllingmitokondrier, [12] grisehjerte-cytosol, [13] og E coli. [14] [15] Totalt sett er den tredimensjonale polypeptidstrukturen for alle arter ganske lik. AST er dimerisk, bestående av to identiske underenheter, hver med omtrent 400 aminosyrerester og en molekylvekt på omtrent 45 kD. [8] Hver underenhet er sammensatt av et stort og et lite domene, samt et tredje domene som består av de N-terminale restene 3-14 disse få restene danner en streng, som kobler og stabiliserer de to underenhetene til dimeren. Det store domenet, som inkluderer rester 48-325, binder PLP-kofaktoren via en aldimin-binding til ε-aminogruppen til Lys258. Andre rester i dette domenet - Asp 222 og Tyr 225 - samhandler også med PLP via hydrogenbinding. Det lille domenet består av restene 15-47 og 326-410 og representerer en fleksibel region som skifter enzymet fra en "åpen" til en "lukket" konformasjon ved substratbinding. [12] [15] [16]

De to uavhengige aktive nettstedene er plassert nær grensesnittet mellom de to domenene. Innenfor hvert aktivt sted er et par argininrester ansvarlige for enzymets spesifisitet for dikarboksylsyresubstrater: Arg386 interagerer med substratets proksimale (α-) karboksylatgruppe, mens Arg292 komplekser med det distale (sidekjeden) karboksylatet. [12] [15]

Når det gjelder sekundær struktur, inneholder AST både α og β elementer. Hvert domene har et sentralt ark med β-tråder med α-helixer pakket på hver side.

Aspartattransaminase, som med alle transaminaser, opererer via dobbel substratgjenkjenning, det vil si at den er i stand til å gjenkjenne og selektivt binde to aminosyrer (Asp og Glu) med forskjellige sidekjeder. [17] I begge tilfeller består transaminasereaksjonen av to lignende halvreaksjoner som utgjør det som kalles en ping-pong-mekanisme. I den første halvreaksjonen reagerer aminosyre 1 (f.eks. L-Asp) med enzym-PLP-komplekset for å generere ketoacid 1 (oksaloacetat) og det modifiserte enzymet-PMP. I den andre halvreaksjonen reagerer ketoacid 2 (a-ketoglutarat) med enzym-PMP for å produsere aminosyre 2 (L-Glu), og regenererer det opprinnelige enzymet-PLP i prosessen. Dannelse av et racemisk produkt (D-Glu) er svært sjelden. [18]

De spesifikke trinnene for halvreaksjonen til Enzyme-PLP + aspartat ⇌ Enzym-PMP + oksaloacetat er som følger (se figur) den andre halvreaksjonen (ikke vist) forløper på motsatt måte, med α-ketoglutarat som substrat. [6] [7]

  1. Intern aldimindannelse: For det første danner ε-aminogruppen til Lys258 en Schiff-baseforbindelse med aldehydkarbonet for å generere et internt aldimin.
  2. Transaldiminering: Det indre aldiminet blir deretter et eksternt aldimin når ε-aminogruppen til Lys258 forskyves av aminogruppen til aspartat. Denne transaldimineringsreaksjonen skjer via et nukleofilt angrep av den deprotoniserte aminogruppen Asp og fortsetter gjennom et tetraedrisk mellomprodukt. Som dette punktet stabiliseres karboksylatgruppene til Asp av guanidiniumgruppene i enzymets Arg386- og Arg 292 -rester. dannelse: Hydrogenet festet til a-karbonet til Asp blir deretter abstrahert (Lys258 antas å være protonakseptoren) for å danne et kinonoid mellomprodukt. dannelse: Kinonoidet blir protrotonert, men nå ved aldehydkarbonet, for å danne ketimin -mellomproduktet.
  3. Ketiminhydrolyse: Til slutt hydrolyseres ketimin for å danne PMP og oksaloacetat.

Denne mekanismen antas å ha flere delvis hastighetsbestemmende trinn. [19] Imidlertid har det blitt vist at substratbindingstrinnet (transaldiminering) driver den katalytiske reaksjonen fremover. [20]

ASAT ligner på alanintransaminase (ALT) ved at begge enzymer er assosiert med lever parenkymale celler. Forskjellen er at ALAT hovedsakelig finnes i leveren, med klinisk ubetydelige mengder som finnes i nyrene, hjertet og skjelettmuskelen, mens ASAT finnes i leveren, hjertet (hjertemuskelen), skjelettmuskulaturen, nyrene, hjernen og rødt blodceller. [ trenger Kilde ] Som et resultat er ALAT en mer spesifikk indikator på leverbetennelse enn ASAT, ettersom ASAT kan være forhøyet også ved sykdommer som påvirker andre organer, for eksempel hjerteinfarkt, akutt pankreatitt, akutt hemolytisk anemi, alvorlige brannskader, akutt nyresykdom, muskuloskeletale sykdommer og traumer. [21]

AST ble definert som en biokjemisk markør for diagnosen akutt hjerteinfarkt i 1954. Imidlertid er bruken av AST for en slik diagnose nå overflødig og har blitt erstattet av hjerte -troponiner. [22]

AST måles vanligvis klinisk som en del av diagnostiske leverfunksjonstester for å bestemme leverhelsen. Det er imidlertid viktig å huske på at kilden til ASAT (og i mindre grad ALAT) i blodprøver kan gjenspeile patologi i andre organer enn leveren. Faktisk, når ASAT er høyere enn ALAT, bør en muskelkilde for disse enzymene vurderes. For eksempel kan muskelbetennelse på grunn av dermatomyositis forårsake AST og gtALT. Dette er en god påminnelse om at ASAT og ALAT ikke er gode måler på leverfunksjonen fordi de ikke pålitelig gjenspeiler leverens syntetiske evne, og de kan komme fra annet vev enn lever (for eksempel muskler).

Laboratorietester bør alltid tolkes ved hjelp av referanseområdet fra laboratoriet som utførte testen. Eksempelreferanseområder vises nedenfor:


DISKUSJON

Translokasjonen av mitokondrielle forløperproteiner til og over OM er en aktivt studert prosess (Pfanner et al., 2004 Neupert og Herrmann, 2007 Chacinska et al., 2009 Schmidt et al., 2010 Endo et al., 2011 Dimmer og Rapaport, 2012). I motsetning til prekursorholdige forløpere, bærere eller β-fatproteiner, er imidlertid svært lite kjent om OM-translokasjonen av proteiner som er målrettet mot IMS via den dedikerte oksidative foldingsveien, MIA. Vår i organello-konkurranseimportanalyse mellom radiomerkede forløpere og forløpere i mettende mengder økte muligheten for at MIA-avhengige forløperproteiner bruker en importrute som er forskjellig fra den klassiske som er tatt av prekursinneholdende forløperproteiner. Imidlertid involverer denne diskrete importveien Tom40-kanalen, fordi vi var i stand til å hemme inngangen til MIA-avhengige proteiner med et alkyleringsmiddel som tilstoppet Tom40-kanalen.

Av betydning viste vi en in vivo interaksjon mellom et modell MIA -substrat, Mix17FLAGGog Tom40. Den sistnevnte observasjonen er interessant fordi det ikke er rapportert om noen fysisk interaksjon mellom MIA-avhengige forløperproteiner og TOM eller andre OM-komponenter. Vi var i stand til å observere et mellomtrinn i den forbigående og dynamiske prosessen med transitt over OM, som kan ha to forklaringer. Først brukte vi en in vivo -tilnærming for å uttrykke et forløperprotein i cellen og følge dets partnere i biogenesen ved hjelp av affinitetsrensninger. For det andre kan valget av Mix17 som et modell MIA-avhengig protein ha fordeler ved å overvåke raske interaksjoner under translokasjon gjennom OM. Mia40 fungerer som en spesifikk og effektiv reseptor for sine substrater på en trans side av OM (Milenkovic et al., 2009 Sideris et al., 2009 von der Malsburg et al., 2011). Dette går sannsynligvis foran en rask interaksjon med maskineriet som er ansvarlig for overføringen av disse forløperproteinene til trans siden av OM. Modelsubstratet vårt, Mix17, tilhører de største MIA-avhengige proteinene (Gabriel et al., 2007). Av interesse, tvillingen CX9C-motiv er lokalisert til C-terminalenden av Mix17 (Böttinger et al., 2012). Disse funksjonene kan påvirke hastigheten på translokasjonen over OM. Støtter denne muligheten, dannelsen av Mia40-Mix17-mellomproduktet som følger OM-translokasjon er mindre effektiv sammenlignet med andre MIA-avhengige underlag (Böttinger et al., 2012). Dette kan igjen favorisere akkumulering av tidligere OM -transportmidler. En lignende translokasjonsmellomform dannes mellom Tom40 og Pet191, om enn med lavere effektivitet, noe som kan forklares med den raskere mitokondrielle importen, etterfulgt av mer effektiv gjenkjenning av Mia40. Dermed identifiserte vi et transportmiddel mellom Mix17FLAGG dannet med Tom40 og viste deretter at andre MIA-avhengige forløperproteiner, slik som Pet191, også dannet dette mellomproduktet.

Av interesse identifiserte vi ikke andre TOM- eller OM-komponenter i translokasjonsmellomproduktet dannet av Tom40 og IMS-destinerte proteiner. Dette var overraskende fordi TIM23-avhengige og preseekvensholdige proteiner under transport samhandler med hele TOM-komplekset, inkludert kjerneunderenhetene, Tom22 og Tom5 (Dekker et al., 1997 Chacinska et al., 2003, 2010 Frazier et al., 2003 Tamura et al., 2009). Videre ble forskjellige importerte forløperproteiner renset ved bruk av Tom22HANS (Chacinska et al., 2003, 2010 Wrobel et al., 2013).I samsvar med fraværet av Tom22 i Tom40-translokasjonsmellomproduktet, var importen av radiomerkede MIA-avhengige forløperproteiner til mitokondrier som mangler Tom22, men også Tom70 og Tom20, upåvirket. De minimerte transportkravene ble også rapportert tidligere for cytokrom c (Wiedemann et al., 2003).

Situasjonen med Tom5 er en annen. Tim9 -kravet for Tom5 ble rapportert tidligere (Kurz et al., 1999 Vögtle et al., 2012) ble bekreftet i de foreliggende eksperimentene. Den funksjonelle avhengigheten av Tom5 ser imidlertid ikke ut til å være et universelt trekk ved IMS-destinerte proteiner. Importen av en subfraksjon av MIA-avhengige proteiner, inkludert Mix17, var upåvirket i fravær av Tom5. Av betydning var Tom5 ikke tilstede i Tom40 -translokasjonsmellomproduktene. På grunnlag av våre data foreslår vi et scenario der funksjonen til Tom5 er indirekte nødvendig på scenen med OM -translokasjon. Fraværet av Tom5 kan endre andre, men ukjente proteiner som er involvert i gjenkjenning og transport av spesifikke IMS-proteiner over OM. Alternativt kan mitokondrier som mangler Tom5 også være svekket i oksidative foldingsreaksjoner. Denne svekkelsen vil resultere i uproduktiv fangst av proteiner i IMS. Våre resultater gir mulighet for eksistens av det endrede TOM -komplekset som ikke inneholder alle typiske TOM -underenheter. Videre kan dynamikken i TOM -maskineriet, det vil si forbigående dissosiasjon ved forløperbinding, ikke utelukkes. Til slutt kan en antatt annen eller mer dynamisk form av Tom40 -translokasen fortrinnsvis dannes in vivo. Oppsummert krysser IMS-destinerte proteiner OM via en Tom40 translokase som er arkitektonisk forskjellig fra det Tom22-inneholdende TOM-komplekset.


INTRODUKSJON

Oppkjøpet av en bakteriell endosymbiont av en primitiv vertscelle og dens påfølgende omdannelse til mitokondrien markerer en av de viktigste overgangene i biologien - den eukaryote cellens inntog (Embley og Martin, 2006). Et avgjørende aspekt ved mitokondrier er deres evne til å importere proteiner fra cytosolen, en prosess som er drevet av et sett med karakteristiske proteintranslokaser (Neupert og Herrmann, 2007 Lithgow og Schneider, 2010 Schmidt et al., 2010 Endo et al., 2011).

I den ytre membranen finner vi to slike translokaser. Den viktigste - den generelle inngangsporten for praktisk talt alle importerte proteiner - er translokasjen til den ytre mitokondriemembranen (TOM). Den består av den poreformende kjerneunderenheten Tom40 (Hill et al., 1998 Ahting et al., 2001), et β-fat-strukturert protein, proteinimportreseptorer (for eksempel Tom70, Tom20 og Tom22 i gjær), og av en rekke mindre underenheter. Den andre translokasen i den ytre membranen er sorterings- og monteringsmaskineriet (SAM), hvis funksjon er innsetting av β-fatproteiner. Kjerneunderenheten er Sam50, som selv er et β-fat protein (Chacinska et al., 2009).

Omfattende studier har avslørt at de fleste komponenter og mye av arkitekturen til TOM og SAM er bevart mellom gjær og pattedyr (Hoogenraad et al., 2002 Dolezal et al., 2006 Schneider et al., 2008 Hewitt et al., 2011). Imidlertid viser en mer global analyse at bare kjernekomponentene i mitokondrielle proteintranslokaser er bevart i alle eukaryoter. Blant disse er Sam50 den mest konserverte: den finnes i alle grupper av eukaryoter og har til og med en bakteriell ortolog, det Omp85-lignende proteinet BamA, som fungerer ved å sette inn β-fatproteiner i den ytre bakteriemembranen (Bos et al., 2007). Tom40 er imidlertid også konservert og funnet i praktisk talt alle eukaryoter, selv om β-fatstrukturen til Tom40 indikerer en bakteriell herkomst, har ingen bakteriell ortolog blitt identifisert (Dolezal et al., 2006 Zeth, 2010).

Reseptorunderenhetene til TOM -komplekset er mye mindre konserverte. Dermed er Tom22 sterkt avkortet i planter, og en konvensjonell Tom20 er fraværende (Mac´asev et al., 2004). I stedet finner vi en strukturell analog av Tom20 som er kodet i omvendt retning, noe som tyder på at den strukturelle likheten mellom pattedyr og sopp Tom20 på den ene siden og planten Tom20 på den andre siden skyldes konvergent utvikling og ikke av vanlig nedstigning (Perry et al., 2006). Det ser ut til at Tom70 mangler i planter (Chan et al., 2006), men har nylig blitt oppdaget hos noen representanter for Chromalveolata, som ikke er relatert til sopp, pattedyr og planter, noe som indikerer at Tom70 kan være mer utbredt enn tidligere antatt (Tsaousis et al., 2011).

Nyere studier på en rekke forskjellige protozoer avslørte interessante, men for det meste mindre avvik fra de kanoniske proteinimportsystemene som er beskrevet hos gjær og pattedyr (Dolezal et al., 2005). Det var derfor en overraskelse at trypanosomatider har et fundamentalt annerledes mitokondrielt ytre membran -translokasjonsmaskineri. Trypanosomatider mangler Tom40 (Pusnik et al., 2009) og i stedet benytte en ytre membranproteinetranslokasjonskanal kalt ATOM, for arkaisk translokase av den ytre mitokondriemembranen (Pusnik et al., 2011). I motsetning til Tom40 har ATOM en bakteriell ortolog. Den viser likheter med en undergruppe av den bakterielle Omp85-lignende proteinfamilien som er forskjellig fra Sam50-ortologen BamA. Dette antyder at trypanosomatider har beholdt et arkaisk ytre membranproteinimportsystem som kan ha gått foran den Tom40-baserte proteinimportkanalen.

Oppdagelsen av ATOM ga uventet ny innsikt i utviklingen av det mitokondriale ytre membranproteinimportsystemet og utviklingen av eukaryoter generelt. Videre reiste det spørsmålet om hvilke andre faktorer som kan være nødvendige for proteintranslokasjon over den ytre membranen av trypanosomale mitokondrier. Ved hjelp av Trypanosoma brucei som et eksperimentelt modellsystem oppdaget vi en så ny faktor. Dette proteinet er et essensielt mitokondrielt ytre membranprotein som er nødvendig for import av et stort undersett, men ikke alle matriseproteiner, og derfor kan ha en reseptorlignende funksjon.


Hvordan skiller transportmekanismer seg fra hverandre?

Et bærersystem som har blitt grundig studert i insektfluemuskler er glyserol -fosfat shuttle. Denne mekanismen bruker tilstedeværelsen på yttersiden av den indre mitokondriemembranen til et FAD-avhengig enzym som oksiderer glyserolfosfat.

Glyserolfosfatet produseres ved reduksjon av dihydroksyacetonfosfat i løpet av reaksjonen, NADH oksideres til NAD +. I denne reaksjonen er oksidasjonsmiddelet (som i seg selv reduseres) FAD, og ​​produktet er FADH2 (Figur 20.23). FADH2 passerer deretter elektroner gjennom elektrontransportkjeden, noe som fører til produksjon av 1,5 mol ATP for hver mol cytosolisk NADH. Denne mekanismen har også blitt observert i pattedyrsmuskler og hjerne.


En mer kompleks og mer effektiv skyttelmekanisme er malate – aspartateshuttle, som er funnet i pattedyrs nyre, lever og hjerte. Denne transporten bruker det faktum at malat kan krysse mitokondriemembranen, mens oxaloacetat ikke kan. Det bemerkelsesverdige poenget med denne skyttelmekanismen er at overføring av elektroner fra NADH i cytosolen produserer NADH i mitokondrien. I cytosolen reduseres oksaloacetat til malat av cytosolisk malat dehydrogenase, ledsaget av oksidasjon av cytosolisk NADH til NAD + (figur 20.24). Malaten krysser deretter mitokondriell mem-brane. I mitokondrion katalyseres omdannelsen av malat tilbake til oksaloacetat av mitokondrielt malat dehydrogenase (et av enzymene i sitronsyresyklusen). Oksaloacetat omdannes til aspartat, som også kan krysse mitokondriemembranen. Aspartat omdannes til oksaloacetat i cytosolen, og fullfører syklusen av reaksjoner.


NADH som produseres i mitokondrionen sender dermed elektroner til elektrontransportkjeden. Med malat -aspartat -skyttelen produseres 2,5 mol ATP for hvert mol cytosolisk NADH i stedet for 1,5 mol ATP i glyserol -fosfat -skyttelen, som bruker FADH2 som transportør.


Diskusjon

Integrerte membran β-fatproteiner finnes i OM-er for gramnegative bakterier og mitokondrier. Monteringen deres krever et evolusjonært konservert protein fra Omp85 -familien, men betydelige tilpasninger av monteringsmaskinene har skjedd under utviklingen. Tilbehørs-proteinene, det vil si fire lipoproteiner når det gjelder bakterier og to cytosol-eksponerte membranassosierte proteiner i mitokondrier, viser ingen sekvenslikhet. Også den Omp85-lignende komponenten tilpasset under evolusjon i tillegg til et membraninnstøpt β-fat-domene, inneholder bakterieproteinene fem periplasma-eksponerte POTRA-domener, mens den mitokondrielle varianten bare inneholder ett slikt domene. Merk at et enkelt POTRA -domene nylig ble vist å være tilstrekkelig for Omp85 -funksjonen i N. meningitidis (Bos et al. 2007b), men i E coli BamA, tre av disse domenene var viktige, selv om også de to andre var viktige for optimal funksjon (Kim et al. 2007).

Ikke bare monteringsmaskinene, men også signalene de gjenkjenner, gjennomgikk tilpasninger under evolusjonen. I tillegg blir disse signalene gjenkjent av forskjellige komponenter i maskineriet, det vil si av Omp85 i bakteriesystemet (Robert et al. 2006) og av Tob38 i mitokondrialsystemet (Kutik et al. 2008). Vi har nylig vist at til tross for disse variasjonene, er den opprinnelige bakterielle OMP-signatursekvensen fortsatt riktig gjenkjent og behandlet av mitokondriemaskineriet (Walther et al. 2009), noe som tyder på at den grunnleggende mekanismen for β-fatproteinsamling kan bli evolusjonært bevart. For å teste denne hypotesen undersøkte vi her om et mitokondrielt OMP, VDAC, kan settes sammen i OM for bakterier, noe som faktisk var tilfelle, og det ble vist å være avhengig av et funksjonelt Bam -kompleks. Vær oppmerksom på at strukturen til VDAC, det vil si en 19-strenget β-fat (Bayrhuber et al. 2008 Hiller et al. 2008 Ujwal et al. 2008), avviker fra de til bakterielle OMP, som alle inneholder et jevnt antall β-tråder (Koebnik et al. 2000). Imidlertid forhindrer denne forskjellen tilsynelatende ikke inkorporering av VDAC i bakteriell OM. I samsvar med denne observasjonen ble en mutant form for porin PhoE som mangler den N-terminale transmembrane β-tråden tidligere rapportert å være funksjonelt innlemmet i E coli OM (Bosch et al. 1988), som demonstrerer at det bakterielle Bam-maskineriet faktisk kan håndtere β-fat med et ulikt antall tråder.

Effektiv montering av VDAC i bakteriell OM var avhengig av dets β-signal, som også er nødvendig for montering i mitokondriell OM (Kutik et al. 2008). Dermed er bakteriesystemet i stand til å dekode de utviklede signalene i mitokondrielle OMP selv om de blir gjenkjent i det autentiske mitokondrielle systemet av en komponent som ikke har tilsvarende i bakteriesystemet. Ved svært høye ekspresjonsnivåer var en mutant form for VDAC som mangler fem C-terminale aminosyrerester og derved påvirkes i dets β-signal, ikke detekterbar ved bakteriecelleoverflaten i immunfluorescensmikroskopiforsøk (fig. 3B). Ved lavere ekspresjonsnivåer syntes imidlertid minst en del av den totale mengden av produsert mutantprotein å være inkorporert i OM (figur 4A og 5A), noe som viser at et intakt β-signal ikke er helt avgjørende for OM-montering av VDAC i E coli. På samme måte er en intakt C-terminal signatursekvens ikke helt avgjørende for riktig montering av en bakteriell OMP i OM. Ved betingelser med høyt uttrykk ble en mutant form av porin PhoE som mangler den C-terminale Phe-resten ikke inkorporert i det hele tatt i E coli OM, men dannet tette periplasmatiske aggregater som pelleterer med membranfraksjonen under sentrifugering og kan visualiseres i cellen ved elektronmikroskopi (Struyvé et al. 1991 de Cock et al. 1997). Ved lavere ekspresjonsbetingelser ble imidlertid dette mutante proteinet satt sammen i OM (de Cock et al. 1997). Antagelig øker den lavere aggregeringskinetikken ved forhold med lavt uttrykk tidsperioden for Bam-maskineriet for å håndtere underlag med et ufullkommen gjenkjenningssignal. På samme måte, da bakterien OMP PhoE ble sterkt uttrykt i gjær, akkumulerte den som utbrettede aggregater i mitokondriene, mens den ble samlet effektivt i mitokondriell OM ved lavere ekspresjonsforhold (Walther et al. 2009).

Lipidsammensetningen kan også potensielt påvirke sammensetningen av integrerte membranproteiner. Faktisk har LPS, en rikelig lipidkomponent i bakteriell OM, blitt implisert i biogenesen til OMP i E coli (Bos et al. 2007a), selv om levedyktige LPS-mangelfulle mutanter av N. meningitidis har blitt beskrevet der OMP -montering virker upåvirket (Steeghs et al. 2001). Lipidsammensetningen til bakteriell OM er ved tilstedeværelse av LPS og fravær av steroler helt forskjellig fra mitokondriell OM, men denne forskjellen er tilsynelatende ikke en uoverstigelig hindring for montering av VDAC i bakteriell OM.

Avslutningsvis ser det ut til at signalgjenkjenning er fleksibel nok til å tillate montering av et mitokondrielt OMP i bakteriell OM. Sammen med den forrige observasjonen at bakterielle OMPer uttrykt i gjær blir satt sammen i mitokondriell OM (Walther et al. 2009), tillater disse dataene konklusjonen at den grunnleggende mekanismen for β-fatproteinsamling er evolusjonært bevart.


Se videoen: LIP FILLER VLOG. 1ml Restylane Kysse, Qu0026A (August 2022).