Informasjon

Hva er fordelene og ulempene ved å bruke beta-galaktosidase sammenlignet med luciferase som et reportergen?

Hva er fordelene og ulempene ved å bruke beta-galaktosidase sammenlignet med luciferase som et reportergen?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

I universitetslaboratoriene har vi brukt Beta-galaktosidase som et reportergen for å kvantifisere uttrykket som initieres av stressrespons-promotoren i gjær. Dette ble gjort ved å utsette den ene av de to gruppene for osmotisk stress (høy saltkonsentrasjon) mens den andre var ustresset. Deretter ble nivåene av beta-galaktosidase sammenlignet. Et spørsmål som ble gitt oss etterpå for å gi fordeler og ulemper ved bruk av Beta-galaktosidase sammenlignet med Luciferase som et reportergen i dette eksperimentet. Og hvilken vil generelt sett være mer egnet?


Beta-galaktosidase (forkortet B-gal) er et enzym som vil behandle substratet laktose. I applikasjoner som bruker B-gal som reporter (lacZ-gen), brukes to laktoseanaloger ofte: X-gal eller ONPG (som påpekt av @Alan Boyd). Begge substratene er fargeløse og blir farget når de er hydrolysert av B-gal. Dannelsen av denne fargen gjør at B-gal kan analyseres ved enten visuell inspeksjon eller mer nøyaktige midler ved bruk av et spektrofotometer eller kamera.

Når X-Gal hydrolyseres, dannes et uoppløselig blått fargestoff. Utviklingen av blå farge intensiveres etter hvert som mer substrat blir hyrolysert, noe som muliggjør rask blå/hvit screening ved visuell inspeksjon i vanlige kloning og genuttrykk. Ved bruk av X-gal-substratet er B-gal-analyser mer følsomme for genuttrykk (fargestoffet faller ut og beholder fargen veldig bra), men X-gal er ikke kvantitativt (Möckli & Auerbach. BioTechniques 36: 872-876 (mai 2004) )). I kontrast utvikler ONPG -hydrolyse et løselig gult fargestoff. Denne fargeutviklingen er kvantitativ, men er mindre senstiv enn X-gal fordi det lineære forholdet mellom lysabsorpsjon (ved 420 nm) og substratkonsentrasjonen er liten. Bruk av ONPG som et B-gal-substrat gir mulighet for kvantitativ måling av B-gal-aktivitet (og derfor promoteraktivitet). (Vær oppmerksom på at ONPG i seg selv ikke er i stand til å indusere lac-promotoren, i motsetning til X-gal.)

Luciferase -journalister (det er faktisk noen få forskjellige luc -gener) opererer på lignende måte. Enzymet klyver sitt substrat, men i stedet for å gi et uoppløselig blått fargestoff, avgir det et karakteristisk foton. Luciferase -aktivitet må måles ved hjelp av spesialisert kameramaskinvare for å oppdage og telle fotoner som sendes ut fra gjærklonene dine. Denne analysen vil fortsatt svare på ja/nei -spørsmål, men kan også kvantifiseres for å se på hvor mye reporteren ble aktivert. Luciferase -aktivitet er en kvantitativ reporter og gir samtidig spatiotemporal informasjon.

Valget av journalister avhenger i stor grad av spørsmålet du ønsker å svare på. Hvis promotorinduksjon er relevant (f.eks. Var stressrespons-promotoren aktivert), så er luciferase eller B-gal med X-gal best egnet for deres høyere følsomhet. Gitt at luciferase krever et spesielt kamera og optisk filter (for eksempel et gel-dokumentasjonssystem), er X-gal ideell fordi den kan screenes med øyet. Hvis promotoraktivitet blir analysert, vil B-gal+ONPG eller luciferase gi kvantitative målinger av reportergenaktivitet, og krever minst et spektrofotometer.

Gitt at dette er universitetslaboratorier, antar jeg at materialkostnadene skal minimeres og at eksperimentell protokoll skal maksimeres, og B-gal er den ideelle journalisten. Luciferase krever: dyrere substrat; spesialisert utstyr; forsiktig håndtering av materialer og mer tid (ettersom screening nødvendigvis tar lengre tid, derfor lavere gjennomstrømning for en lab -demoinnstilling).


Jeg tror at @leonardo har dette bakover. β-galaktosidase kan analyseres nøyaktig og billig ved bruk av ONPG som et kolorimetrisk substrat uten løselighetsproblemer. Alt som trengs er et spektrofotometer: jeg antar at dette er analysen OP brukte i eksperimentet. Så mitt svar er - bruk β -galaktosidase for billig kvantitativ analyse - du trenger ikke å tilsette luciferin og ATP eller bekymre deg for oksygen tilgjengelighet. Jeg sliter med å tenke på en ulempe for β -galakosidase - kanskje det er høyere bakgrunnsnivåer fra andre cellulære glykosidaser, mens det ikke vil være noen bakgrunns luciferaseaktivitet?


Jeg skjønner at dette spørsmålet handler om gjær, men jeg er redd for at folk kan prøve å utvide svaret til alle systemer, og beta -galaktosidase er ikke bra for alle systemer, spesielt for dyreforsøk. Jeg har sett for mange genterapipapirer prøve å slippe unna med å bruke det.

Betagalaktosidase er ikke et godt reportergen for in vivo genleveringsstudier. Det er for mye endogen aktivitet i de fleste vev til å skille den eksogene aktiviteten. Når du utfører ikke -viral genlevering, er mengden av DNA som er uttrykt ofte så lav at du ikke kan overvelde den endogene aktiviteten og derfor ikke kan si definitivt at enzymaktiviteten du oppdaget er fra ditt nye DNA.

Luciferase er langt bedre for in vivo -arbeid. For det første er det ingen endogen luciferaseaktivitet hos de fleste dyr (du har ikke flaks hvis du jobber med ildfluer), så du kan være sikker på at enhver luciferase -aktivitet du oppdager er ekte. Luciferaseaktivitet kan bestemmes ikke -invasivt gjennom bioluminescerende avbildning, noe som muliggjør gjentatte målinger på det samme dyret. Betaglukosidase kan kreve å drepe dyret, dissekere vevet, forberede objektglass og deretter analysere, så det vil kreve bruk av mange flere dyr for å gjøre en tidsstudie.

Den eneste fordelen jeg kan se at betaglukosidase har over luciferase er hvis du vil se hvor stor prosentandel eller nøyaktig hvilken type celler som uttrykker reportergenet. Imidlertid tror jeg GFP eller et annet fluorescerende protein ville være mer passende på grunn av det endogene aktivitetsproblemet jeg beskrev tidligere.

Igjen, svaret mitt gjelder dyrebruk. Hvis du bare dyrker gjær på en tallerken, er betagalaktosidase sannsynligvis den billigere måten å gå. Vi gjorde noen 384 og 1536 brønnplateanalyser på primære hepatocytter med luciferase, og luciferasereagenset var omtrent $ 250 for 10 ml. Du kan også vurdere fluorescerende proteiner for screening. Jeg har laget baktierale kolonier med RFP som var synlig røde, så det er ikke behov for UV, men selv om du trenger UV -lys for å se fluorescensen, vil en standard UV -transluminator for visning av geler være god nok, og ingen ekstra reagenser å legge til.


Reportergenfusjoner *

C. elegans har særpreg som kjennetegner denne organismen for visualisering av genuttryksmønstre ved bruk av reportergenene grønt fluorescerende protein (GFP Chalfie et al., 1994) og β GAL (LacZ Fire et al., 1990). Åpenheten av C. elegans gir mulighet for mikroskopisk analyse in vivo uten dyredisseksjon. I tillegg lindrer den relative tynnheten til dyr (omtrent 75 og 956 m tverrsnitt) ofte behovet for kraftig konfokalmikroskopi. Til slutt tillater germline -transformasjonsteknikker rask generering av transgene dyr.

De E coli genet LacZ , koding β -galaktosidase, ble først brukt for encellede genuttrykkanalyser i C. elegans i 1990 (Harrison et al., 1990) og var det foretrukne reportergenet til introduksjonen av GFP i 1994 (Chalfie et al., 1994). Den primære fordelen med GFP fremfor LacZ er evnen til å visualisere reportergenuttrykk hos levende dyr i stedet for i faste preparater. Derfor kan GFP lettere brukes til en rekke formål, inkludert (1) uttrykksmønsteranalyse, (2) disseksjon av cis -regulerende sekvenser, (3) proteinlokalisering, (4) visualisering av cellulær anatomi (f.eks. neuroanatomi), (5) celleidentifikasjon og (6) visualisering av cellulære og fysiologiske prosesser (Chalfie et al., 1994 Hobert og Loria, 2005). Av disse grunnene har GFP -reportertransgener blitt det primære verktøyet for analyse av genuttrykk i C. elegans . Vi vil fokusere på GFP fra nå av, med tanke på at LacZ i mange tilfeller kan erstatte GFP. I dette kapitlet beskriver vi protokoller for generering av GFP -reporterkonstruksjoner og gir flere tekniske hensyn.

1.2. Kategorier av reportergenkonstruksjoner

Et avgjørende aspekt ved genuttrykkstudier er å velge en passende type reporter for eksperimentets formål. Hver reporter varierer i mengden informasjon den gir om uttrykk for et gen. De tre generelle typene reportergenkonstruksjoner er: 1) transkripsjonelle journalister, 2) translasjonelle journalister og 3) " smg-1 -baserte "transkripsjonelle journalister (figur 1).

Transkripsjonelle journalister består av et promoterfragment fra et gen av interesse som driver GFP (figur 1A). Vanligvis inneholder promotorfragmenter på noen få kilobaser umiddelbart oppstrøms startkodonet en betydelig del av cis -regulerende informasjon nødvendig for å gi et foreløpig ekspresjonsmønster for det endogene genet som studeres.

Figur 1. Arkitektur av reportergenkonstruksjoner. (A) transkripsjonsreporter, (B) oversettelsesreporter, (C) " smg-1 -basert "reporter. Ikke-kodende DNA-sekvenser er indikert med svarte linjer. Exonsekvenser er representert som blå bokser. GFP er vist i grønt.

Oversettelsesreporter er genfusjoner i rammen mellom GFP og et gen av interesse (figur 1B). Ideelt sett inkluderer en translasjonsreporter hele det genomiske locuset til et gen (5 ′ oppstrøms region, eksoner, introner, 3 ′ UTR). GFP kan settes inn når som helst i den åpne leserammen, helst på et sted som ikke forstyrrer proteinfunksjon eller topologi.

smg-1 - baserte journalister er transkripsjonelle journalister som har som mål å inkludere alle cis -regulerende informasjon om et gen. GFP, inkludert stoppkodonet, settes inn mellom promotoren og den første eksonen (figur 1C). Derfor blir transkripsjonen av transgenet kontrollert av cis -regulerende sekvenser funnet oppstrøms, intronisk eller nedstrøms for genet av interesse, men bare GFP blir oversatt. Imidlertid er inkludering av GFP-stoppkodonet målrettet mot det produserte mRNA for tullmediert mRNA-forfall (Pulak og Anderson, 1993 Wilkinson et al., 1994 Mango, 2001). Derfor må disse reporterne injiseres i en genetisk bakgrunn som er mangelfull for tullmediert mRNA-forfall, som f.eks. smg-1 (Mango, 2001).

1.3. Sekvenser som skal inkluderes i reporterkonstruksjoner

De C. elegans genomet er veldig kompakt. Mest cis -regulerende informasjon ligger innenfor flere kilobaser umiddelbart oppstrøms et gen. Imidlertid er det et økende antall eksempler som er avgjørende cis -regulerende sekvenser er funnet innenfor introner (spesielt gener som inneholder store introner Wenick og Hobert, 2004) eller 3 ′ UTR (Wightman et al., 1993). Sjeldnere ennå, cis -regulerende sekvenser er funnet på uvanlig lange avstander (utover oppstrøms eller nedstrøms flankerende gener) fra genet av interesse (Conradt og Horvitz, 1999 Wenick og Hobert, 2004).

Bortsett fra ekstreme eksempler, inkluderer de vanligste reportergenkonstruksjonene ganske enkelt en stor del av 5 ′ intergeniske sekvens (transkripsjonell reporter). Ideelt sett bør journalister inneholde så mye cis -regulerende sekvens, fra oppstrøms til nedstrøms gen, som teknisk mulig (translasjonell og smg-1 -baserte journalister).

I løpet av det siste tiåret har det blitt klart at mikroRNA spiller en viktig rolle i post-transkripsjonell genregulering (via 3 ′ UTR Ambros, 2004). Derfor kan transkripsjonelle journalister, som ikke inkluderer den endogene 3 ′ UTR, ikke nøyaktig representere ekspresjonsmønstrene til gener regulert av mikroRNA.

1.4. Genomfattende genuttrykksprosjekter

Gitt tilgjengeligheten av hele C. elegans genom-sekvens, har flere grupper påtatt seg genomfattende genuttrykksprosjekter. Tre grupper genererer systematisk promoter :: GFP -fusjoner og dokumenterer de resulterende uttrykksmønstrene. Resultater og tilleggsinformasjon er tilgjengelig via de respektive nettstedene:

Hope Lab Expression Patten Database: http://bgypc059.leeds.ac.uk/

1.5. Tekniske hensyn

1.5.1. Kommentarer til forskjellige reportertyper

Transkripsjonelle journalister kan brukes til raskt å etablere et foreløpig uttrykksmønster for et gen av interesse. Fusjonering av 5 ′ oppstrøms sekvenser til GFP kan gjøres på en rekke måter og gir vanligvis ingen teknisk utfordring. Sammenlignet med oversettelse og smg-1 -baserte journalister, men promotor fusjoner gir kanskje ikke en fullstendig representasjon av det reelle ekspresjonsmønsteret til et gen, både romlig og tidsmessig.

Oversettelsesreporter kan gi en trofast representasjon av et gens ekspresjonsmønster fordi ytterligere regulatorisk informasjon som kan være tilstede i introner eller 3 ′ UTR er inkludert i slike reporterkonstruksjoner. Når mutanter er tilgjengelige, kan oversettelsesreportører brukes i redningsforsøk. Vellykket redning av den mutante fenotypen gir støtte til den funksjonelle relevansen av de resulterende uttrykksmønstrene. I tillegg kan translasjonelle genfusjoner også gi informasjon om subcellulær lokalisering og de tidsmessige aspektene ved genregulering. Oversettelsesfusjoner kan virke mindre lyse enn transkripsjonelle fusjoner på grunn av den iboende ustabiliteten til proteinet smeltet til GFP. Imidlertid kan innsetting av GFP intragenisk noen ganger forstyrre proteinfunksjonen eller til og med føre til toksisitet av det kimære produktet. Til slutt kan translasjonsreporter som viser subcellulær lokalisering gjøre identifikasjon av celletype vanskeligere fordi cellens form kanskje ikke er synlig (spesielt for nevroner).

smg-1-baserte journalister representerer uttrykksmønstre like nøyaktig som translasjonsreporter. GFP produsert av disse reporterne er ikke lokalisert, noe som kan lette celletypeidentifikasjon. Den største ulempen ved smg-1 -baserte journalister er at de krever a smg-1 mutasjon i den genetiske bakgrunnen.

1.5.2. Vector ryggrader

Et stort antall vektorryggrader og reportergenderivater er tilgjengelige fra Fire Vector Kit konstruert av Andrew Fire's lab. I tillegg til de grunnleggende strukturelle elementene i ekspresjonsvektorene (Multiple Cloning Site, kunstig intron, reportergen, 3 ′ UTR se Cloning) er noen vektorer konstruert for å inneholde kjernefysisk lokalisering, membranmålretting eller mitokondriale målsignaler. Vektorene, sekvensfilene deres, detaljerte beskrivelser og instruksjoner for bruk av disse vektorene er tilgjengelige på: http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&cmd=showcol&colid=1 eller ftp://ftp.wormbase.org/pub /ormbase/datasett/brannvektorer. Noen av de mest nyttige vektorene fra Fire Vector Kit er oppført i tabell 1.

Tabell 1. Nyttige vektorgrupper: GFP/LacZ/DsRed -reportervarianter

Vector Beskrivelse Lokalisering
pPD95.75 (L2463) GFP [S65C] Ingen
pPD16,43 LacZ 1xNLS Cellekjernen
pDsRed DsRed Clontech -
pDsRed2 DsRed2 Clontech -
pPD135.83 (L4796) GFP [S65C] 2xSV40-NLS Nucleolus og Nucleus
pPD136.15 (L4809) GFP [S65C] 3xSV40-NLS Nucleolus & gt Nucleus
pPD133.48 (L4663) CFP [Y66W, N146I, M153T, V163A] 1xSV40-NLS Nucleus & gt Cytoplasma
pPD133.45 (L4660) CFP [Y66W, N146I, M153T, V163A] :: lacZ 1xSV40-NLS Bare kjernen
pPD132.112 (L4643) YFP [S65G V68A S72A T203Y] 1xSV40-NLS Nucleus & gt Cytoplasma
pPD133.63 (L4671) YFP [S65G V68A S72A T203Y] :: lacZ 1xSV40-NLS Bare kjernen
pPD122.39 (L4058) PAT-3-GFP [S65C] PAT-3 transmembrane domene Plasmamembran
pPD133.54 (L4665) Mt :: CFP [Y66W, N146I, M153T, V163A] Mitokondrier
pPD133.60 (L4667) Mt :: YFP [S65G V68A S72A T203Y] Mitokondrier

Fire Vector Kit inkluderer ikke røde fluorescerende proteinvarianter, men DsRed og DsRed2 fra Clontech har blitt byttet ut med GFP i reportertransgener i C. elegans (f.eks. Wenick og Hobert, 2004).

1.6. Flerfargede GFP -ekspresjonssystemer

Tilgjengeligheten av GFP-varianter med ikke-overlappende utslippsspektre (Cyan-FP, Yellow-FP) har åpnet muligheten for flerfarget merking av C. elegans celler in vivo . CFP- og YFP -varianter kan skilles ved bruk av passende filtersett (Miller et al., 1999). Nylig har trippelfargekombinasjoner (CFP, YFP, DsRed) blitt brukt med hell for å merke separate klasser av nevroner (Hutter, 2003).

1.7. Vanlige artefakter

Av liten betydning for eksperimentisten, men fascinerende i seg selv, er autofluorescensen som vises i tarmkornene og nukleolene til hypodermale celler i C. elegans . Disse fenomenene er ikke et resultat av avvikende reportertransgenuttrykk, men forekommer naturlig i C. elegans .

I motsetning til ikke-GFP-relatert autofluorescens, kan GFP-reportere noen ganger indusere uspesifikk fluorescens i bakre tarmceller. Denne observerte effekten antas å være en indirekte konsekvens av unc-54 3 ′ UTR, som brukes i de fleste vektorer fra Fire Kit (se http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&cmd=showcol&colid=1 eller ftp://ftp.wormbase.org/pub/ ormbase/datasett/brannvektorer).

1.8. Fluorofor modning av fluorescerende proteiner

Studier av midlertidig genregulering er avhengige av evnen til å oppdage svingninger i genuttrykk i et smalt tidsvindu. En ulempe ved å bruke fluorescerende proteiner for slike eksperimenter er tiden som kreves for modning av fluoroforen.

Studier utført i E coli har funnet t0.5 for modning til 27 minutter for S65T -varianten av GFP (brukt i pPD95.75 og dets derivater Heim et al., 1995). Bevis fra C. elegans eksperimenter antyder at GFP S65T modnes i samme hastighet i ormen, som CFP- og YFP -varianter. De røde fluorescerende proteinene, DsRed og DsRed2, modnes betydelig langsommere. Imidlertid har det blitt generert nye varianter av DsRed som er lysere, modnes raskere (Shaner et al., 2004) og fluorescerer i C. elegans (Etchberger, upublisert).

Noen ganger kan uttrykk fra svake promotorer kreve en langvarig akkumulering av protein før et fluorescerende signal kan påvises in vivo . I disse tilfellene kan antistofffarging avsløre uttrykk for det fluorescerende proteinet før et detekterbart fluorescerende signal oppnås.

1.9. Coinjection markører

En rekke standard myntkastmarkører er tilgjengelige for å merke reportergenholdige ekstrakromosomale matriser i C. elegans . Den mest brukte markøren er rol-6 (su1006) (Kramer et al., 1990). rol-6 (su1006) er en dominerende allel som kan brukes til å merke matriser i de fleste genetiske bakgrunner, noe som gjør det enkelt å velge og vedlikeholde transgene linjer. Alternative injeksjonsmarkører som krever spesifikk mutants bakgrunn inkluderer: pha-1 , dpy-20 , unc-4 , lin-15 (se seksjonen WormMethods: Transformasjon og mikroinjeksjon). Spesielt GFP -journalister, som f.eks ceh-22 :: gfp , unc-122 :: gfp , elt-2 :: gfp , og ttx-3 :: gfp har blitt brukt som injeksjonsmarkører i seg selv.

1.10. Avsluttende kommentar

Reportertransgener representerer kanskje ikke det fullstendige ekspresjonsmønsteret for et gen, men gir likevel testbare hypoteser om stedet for genfunksjonen. Det har blitt standard å supplere disse hypotesene med celletypespesifikke redningsforsøk, mosaikkanalyse og antistofffarging. For tidlige embryostudier, in situ hybridisering kan også være informativ.


Luminescens: Mekanismer og applikasjoner for 4 fremtredende teknikker

Luminescens - eller utslipp av lys fra et stoff som ikke er fysisk oppvarmet - brukes ofte i vitenskapen for å gi visualisering av enheter som normalt ikke er synlige for det menneskelige øye. Kjemiske reaksjoner kan brukes til å lage luminescens uten bruk av eksterne lyskilder i teknikker som bioluminescens og kjemiluminescens. Andre former for luminescens krever imidlertid eksternt lys for å utløse en glød i et stoff. Disse sistnevnte former for luminescens omtales som fotoluminescens og inkluderer fluorescens og fosforescens.

Nedenfor er en kort oversikt over disse teknikkene og hvordan de brukes i biovitenskapelig forskning.

Bioluminescens

Bioluminescens refererer til den kraftige evnen til å se hva som skjer inne i organismer gjennom utslipp av synlig lys. 1 Teknikken gjør det mulig for forskere å studere biologiske prosesser i sanntid, in vivo. Den har blitt utviklet i løpet av de siste tiårene og ble hovedsakelig brukt i smådyr for molekylær avbildning.

Bioluminescens virker ved å detektere synlig lys som dannes når et enzym oksiderer et molekylært substrat. Oftest er enzymet, som omtales som en bioluminescerende reporter, ildflueluciferase. 2 Imidlertid har luciferaser klonet fra andre arter også blitt ansett som nyttige. Disse luciferasene kommer fra organismer, inkludert maneter, koraller, biller og bakterier. 3 Renilla luciferase reportergen er et annet vanlig enzym i bioluminescens. 4

Gitt at pattedyrvev ikke har noen egen bioluminescens, har bilder generert med bioluminescens et høyt signal-til-støy-forhold, og teknikken kan brukes til å visualisere aktivitet i indre organer. 1 Selv om den spesifikke følsomheten for bioluminescensavbildning avhenger av flere faktorer, for eksempel dybden til de merkede cellene, følsomheten til deteksjonssystemet og nivået av luciferaseuttrykk, har fremskritt innen detektorteknologi forbedret følsomheten og resulterende bildekvalitet. 5

Det finnes et bredt spekter av forskningsapplikasjoner for bioluminescens, inkludert overvåking av grunnleggende aktivitet som proteininteraksjoner og intracellulær motilitet, i tillegg til å overvåke mer klinisk relevante prosesser som infeksjonprogresjon, tumorvekst og metastase, transgenuttrykk og virkningen av genterapi. 1,6–8 En av de mest fremtredende reportergenanalysene som brukes i farmasøytisk utvikling-den luminescerende reportergenanalysen-bruker bioluminescens fordi denne teknikken bidrar til relevante screeningsprosesser med høy gjennomstrømning. 9

Kjemiluminescens

I likhet med bioluminescens, er kjemiluminescens en svært sensitiv metode for deteksjon av fotoemisjoner som har fordelen av at den ikke krever en ekstern lyskilde og derfor unngår utfordringene forbundet med fotoblekning, lysspredning og auto-luminescens. 10 Som med bioluminescens, bidrar denne funksjonen til kjemiluminescens til høyere signal-til-støy-forhold enn andre luminescensmetoder, noe som gjør chemiluminescence til en veletablert teknikk med mange bruksområder.

Med kjemiluminescens oppdages lys på grunn av en reaksjon av et substrat med en reaktiv oksygenart. Kjemiluminescens utnytter ofte prosessen der hestereddikperoksidase katalyserer oksidasjonen av luminol- eller oksalatestere med hydrogenperoksid, selv om andre substrater også brukes. 10

Fordelene ved kjemiluminescens kan realiseres ved å bruke begge deler in vitro og in vivo applikasjoner. 11,12 Teknikken kan for eksempel hjelpe til med påvisning av flere analytter, inkludert proteiner enzymer nukleinsyre og til og med celler. 13,14 Det kan også muliggjøre sanntidsovervåking av fysiologi og patologi og er derfor nyttig for å undersøke aspekter ved medikamentlevering og tumorvekst. 15

Selv om kjemiluminescens deler mange av fordelene med bioluminescens, har den også noen relative ulemper. For eksempel, i motsetning til bioluminescens, støtter kjemiluminescens ikke overvåking av prosesser som skjer dypt i vev fordi teknikken har et svakt vevspenetrasjonspotensial, og visualiseringseffektene er kortvarige. 16

Fotoluminescens

Fotoluminescens krever at et molekyl absorberer lysstråling og at dets elektroner blir begeistret. Når dette skjer, transformeres molekyler fra grunntilstanden til en eksitert tilstand. Fordi den opphissede tilstanden er ustabil, vender molekylet uunngåelig tilbake til grunntilstanden og forsvinner energi.

Fluorescens oppstår på grunn av forskjeller i spennende og avgivende bølgelengder. 17 Etter at en foton av lysenergi er absorbert, mister den litt energi og avgir et annet foton nanosekunder senere i det som omtales som Stokes -skiftet. Det utsendte fotonet bærer mindre energi, og lyset har derfor en lengre bølgelengde enn bølgelengden til det absorberte lyset.

Fluorescerende objekter er synlige når det eksiterte lyset er blokkert, men det utsendte lyset ikke er det. Denne tilnærmingen til luminescens gir overlegen kontrast sammenlignet med absorpsjonsmetoder som innebærer farging med midler som absorberer lys, for eksempel Gram -flekker. 18 Fordi fluorescerende fargestoffer ofte absorberer lys som bare er litt forskjellig fra bakgrunnen, kan kontrasten de produserer begrenses. 17

Fluorescens brukes i konvensjonelle laboratorieteknikker. For eksempel benytter western blot (eller immunoblot) denne teknikken for å kvantifisere proteiner. Flowcytometri bruker også fluoroforer - som kan absorbere og avgi lys innenfor et område av bølgelengder - i kombinasjon med antistoffer for å oppdage biologiske markører.

Det er dårlig signal-til-støy når fluorescens brukes i tykkere vevsprøver fordi eksitasjonslyset må trenge gjennom flere andre biologiske lag som fører til autofluorescens. Noen forsøk på å forbedre kontrasten mellom bakgrunnen og interessenheten har ført til fluorescensmikroskopi, som nå er en integrert del av mikroskopien som brukes i biologiforskning. 19

I likhet med fluorescens oppstår fosforesens på grunn av forskjellen i bølgelengden til absorberte og utsendte fotoner. Imidlertid lagres og slippes mer energi ut i fosforesens enn i standard fluorescens -teknikker. Følgelig innebærer fosforescens generelt mye større Stokes -skift og lengre utslippsperioder enn standard fluorescens.

Bruken av fosfororescens har blitt utvidet de siste tiårene på grunn av noen spesifikke fordeler ved denne teknikken, inkludert høy følsomhet, selektivitet og tidsoppløst deteksjon. I tillegg, mens fosforesens -teknikker en gang var begrenset til faste faser eller lave temperaturer, har det nylig utviklet seg nye tilnærminger som tillater flytende tilstand og romtemperaturfosforesens.

Luminescens er et viktig verktøy i forskning innen biovitenskap, spesielt for å visualisere molekyler og biologiske prosesser. Den beste luminescens -tilnærmingen avhenger av de spesifikke målene med forskningen. Å navigere i noen av disse verktøyenes applikasjoner kan bidra til å belyse deres relative fordeler og ulemper.

  1. Sadikot RT, Blackwell TS. Bioluminescens avbildning. Proc Am Thorac Soc. 20052 (6): 511-512,537-540. doi: 10.1513/pats.200507-067DS
  2. de Wet JR, Wood K V, Helinski DR, DeLuca M. Kloning av ildflu luciferase cDNA og uttrykk for aktiv luciferase i Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 198582 (23): 7870-7873. doi: 10.1073/pnas.82.23.7870
  3. Hastings JW. Kjemi og farger på bioluminescerende reaksjoner: en anmeldelse. Gene. 1996173 (1 spesifikasjonsnummer): 5-11. doi: 10.1016/0378-1119 (95) 00676-1
  4. Thorne N, Inglese J, Auld DS. Lysende innsikt i ildflueluciferase og andre bioluminescerende journalister som brukes i kjemisk biologi. Chem Biol. 201017 (6): 646-657. doi: 10.1016/j.chembiol.2010.05.012
  5. Wilson T, Hastings JW. Bioluminescens. Annu Rev Cell Dev Biol. 199814: 197-230. doi: 10.1146/annurev.cellbio.14.1.197
  6. Tang Y, Shah K, Messerli SM, Snyder E, Breakefield X, Weissleder R. In vivo sporing av nevral stamcellemigrasjon til glioblastomer. Hum Gene Ther. 200314 (13): 1247-1254. doi: 10.1089/104303403767740786
  7. Benaron DA, Contag PR, Contag CH. Imaging hjernens struktur og funksjon, infeksjon og genuttrykk i kroppen ved hjelp av lys. Philos Trans R Soc London Ser B, Biol Sci. 1997352 (1354): 755-761. doi: 10.1098/rstb.1997.0059
  8. de Almeida PE, van Rappard JRM, Wu JC. In vivo bioluminescens for sporing av celleskjebne og funksjon. Er J Physiol Heart Circ Physiol. 2011301 (3): H663-71. doi: 10.1152/ajpheart.00337.2011
  9. Miraglia LJ, King FJ, Damoiseaux R. Ser lyset: selvlysende reportergenanalyser. Comb Chem skjerm med høy gjennomstrømning. 201114 (8): 648-657. doi: 10.2174/138620711796504389
  10. Yan Y, Shi P, Song W, Bi S. Chemiluminescence and Bioluminescence Imaging for Biosensing and Therapy: In Vitro and In Vivo Perspectives. Teranostikk. 20199 (14): 4047-4065. doi: 10.7150/thno.33228
  11. Roda A, Pasini P, Guardigli M, Baraldini M, Musiani M, Mirasoli M. Bio- og kjemiluminescens i bioanalyse. Fresenius J Anal Chem. 2000366 (6-7): 752-759. doi: 10.1007/s002160051569
  12. Jansen EH, Buskens CA, van den Berg RH. Et sensitivt CCD -bildesystem for påvisning av kjemiluminescerende reaksjoner. J Biolumin Chemilumin. 19893 (2): 53-57. doi: 10.1002/bio.1170030204
  13. Suzuki K, Nagai T. Nylig fremgang med å utvide den kjemiluminescerende verktøykassen for biobilder. Curr Opin Biotechnol. 201748: 135-141. doi: 10.1016/j.copbio.2017.04.001
  14. Hananya N, Shabat D. A Glowing Trajectory between Bio- and Chemiluminescence: From Luciferin-Based Probes to Triggerable Dioxetanes. Angew Chem Int Ed Engl. 201756 (52): 16454-16463. doi: 10.1002/anie.201706969
  15. Niu G, Zhu L, Ho DN, et al. Longitudinal bioluminescence imaging av dynamikken i Doxorubicin indusert apoptose. Teranostikk. 20133 (3): 190-200. doi: 10.7150/thno.5825
  16. Pu K, Chattopadhyay N, Rao J. Nylige fremskritt for halvledende polymer -nanopartikler innen in vivo molekylær avbildning. J Kontrollutløser. 2016240: 312-322. doi: 10.1016/j.jconrel.2016.01.004
  17. Lichtman JW, Conchello JA. Fluorescensmikroskopi. Nat Metoder. 20052 (12): 910-919. doi: 10.1038/nmeth817
  18. Becerra SC, Roy DC, Sanchez CJ, Christy RJ, Burmeister DM. En optimalisert fargeteknikk for påvisning av grampositive og gramnegative bakterier i vev. BMC Res Notes. 20169: 216. doi: 10.1186/s13104-016-1902-0
  19. Sanderson MJ, Smith I, Parker I, Bootman MD. Fluorescensmikroskopi. Cold Spring Harb Protoc. 20142014 (10): pdb.top071795. doi: 10.1101/pdb.top071795

Nisha Cooch, PhD

Dr. Nisha Cooch tok sin doktorgrad i nevrovitenskap fra University of Maryland School of Medicine. Dr. Cooch har forsket på National Institutes of Health (NIH) og tjent som en American Association for the Advancement of Science (AAAS) Science and Technology Policy Fellow. Hun er publisert i populære medier samt fagfellevurderte tidsskrifter som Nature Neuroscience.


Luminescens

Luminescens er utslipp av lys fra et stoff som følge av en kjemisk reaksjon (kjemiluminescens) eller en enzymatisk reaksjon (bioluminescens).

Luminescensdeteksjon er optisk enklere enn fluorescensdeteksjon, da det ikke krever en lyskilde eller spesifikk optikk for eksitasjon.

Figur 1 - Flash og Glow -reaksjon

Luminescens kan enten være en "flash" eller en "glow" -reaksjon, avhengig av de kinetiske profilene. Flash -luminescens gir et veldig sterkt signal i en kort periode, vanligvis sekunder. Glød luminescens avgir et mer stabilt, men vanligvis mindre intens signal som kan vare i flere minutter eller timer. Flash -luminescens krever vanligvis et deteksjonssystem med injektorer som kan levere substrat til reaksjonen kort tid før måling, slik at signalet ikke blir savnet. Hvite mikroplater anbefales vanligvis for luminescens da de reflekterer lys og maksimerer signalet. (se figur 1)


Forskningsteknologi

Det økende antallet eksperimentelt karakteriserte TFBS-er fikk noen databaser til å begynne å samle inn TFBS-relatert informasjon (tabell 1) [46–49]. Eksempler inkluderer TRANSFAC og JASPAR, som er to store TF -databaser [50]. I TRANSFAC er de eksperimentelt avledede TFBSene merket med de tilhørende eksperimentelle teknikkene og betingelsene, og troverdigheten til de oppdagede stedene har blitt evaluert [51]. Videre inneholder TRANSFAC de fleste dataene så vel som den mest omfattende relaterte informasjonen. Det er imidlertid noen ulemper med denne databasen, inkludert informasjonsredundans og den betydelige variasjonen i modellkvalitet. Videre gir TRANSFAC bare noen data til ideelle organisasjoner. I kontrast er JASPAR den mest omfattende og offentlig tilgjengelige databasen over matrise-baserte TF-bindende profiler. Disse profilene ble utelukkende avledet fra publiserte eksperimentelt definerte steder og lagres som posisjonsfrekvensmatriser [52–57].

Begge de store TF-relaterte databasene gjør det mulig for forskere å forutsi DNA-bindende motiver til TF. TFBS -ene er bevart, men er ikke identiske, og viser i stedet et spesifikt mønster (dvs. motiv). Med utviklingen av algoritmer anses vektmatrisen å være en generell og nøyaktig tilnærming for å beskrive motivegenskaper [50, 61]. En posisjonsvektmatrise (PWM), som også er kjent som en posisjonsspesifikk vektmatrise eller posisjonsspesifikk poengmatrise, er en vesentlig og vanlig moderne algoritme for å oppdage motiver. Match ™ er et kraftig nettbasert og vektmatrisebasert verktøy som er nært forbundet med PWM-biblioteket i TRANSFAC-databasen. Matriselikhetspoeng og kjernelikhetspoengsum brukes av Match ™ for å søke etter antatte TFBS i promotorsekvensen til målgener [37]. JASPAR -databasen anbefaler bruk av datasettene og ConSite -verktøyet i stedet for egne verktøy [38]. ConSite er et nettbasert og brukervennlig verktøy som bruker TF av høy kvalitet og fylogenetisk fotavtrykk for å forutsi TFBS [38]. Fylogenetisk fotavtrykk refererer til det faktum at selektivt trykk gjør funksjonelle regulatoriske regioner mer bevarte enn regioner uten sekvensspesifikk funksjon i ikke-kodende regioner [62, 63]. Følgelig forutsies TFBS ved å lete etter bevarte motiver av homologe gener i flere arter. Selv om profilbaserte modellrammer er i stand til å beskrive TFBS-er nøyaktig, er de forutsagte TFBS-ene ikke nødvendigvis riktige. For eksempel er noen funksjonelle reguleringssteder mindre bevart enn bakgrunnssekvenser.

Analyse for Transposase Accessible Chromatin ved hjelp av sekvensering (ATAC-seq) er en rask og sensitiv metode for å forutsi proteinbindende motiver belegggenom-utbredt [64]. Det som er kjent for alle er at DNA er utilgjengelig i eukaryote celler, fordi DNA og nukleosomer er pakket inn i kromatin [65]. Når kromatinet endres fra kondensert tilstand til tilgjengelig tilstand, har TFer eller andre DNA-bindende proteiner tilgang til DNA og deretter regulert genuttrykk [65]. Transposoner anses fortrinnsvis innsatt i områder med tilgjengelig kromatin. ATAC-seq, basert på funksjonen til hyperaktiv Tn5-transposase, er i stand til å fange åpne kromatinsider [64]. Sammenlignet med DNase-seq og FAIRE-seq, er ATAC-seq enkel og mer effektiv. Eksistensen av cellevegger og forurensning av subcellulære organeller påvirker anvendelsen av ATAC-seq i anlegg. Roger B. Deal isolerte kjerner ved INTAKT (isolering av kjerner merket i spesifikke celletyper) for å optimalisere ATAC-seq [66]. Fluorescensaktiverte kjernesorteringsanalyser ble også brukt for å optimalisere ATAC-seq [67]. Chromatin immunoprecipitation sequencing technique (ChIP-seq) er en omfattende eksperimentell kombinasjon av biologimetode med silikoanalyser. Kombinasjonen av ATAC-seq og ChIP-seq kan brukes til å forutsi bindingen av TFene av interesse til DNA [64, 68]. Imidlertid har disse nye teknologiene uunngåelig visse avvik [69]. Derfor må forskere teste de forutsagte nettstedene med et nytt eksperiment.

Gjær en-hybrid analyse

Gjær-en-hybrid (Y1H) analysen er en viktig teknikk for å vurdere fysiske interaksjoner mellom TF og deres målpromotører. Analysen er basert på gjær to-hybrid protein-protein interaksjon analysen. Y1H -analysen består av følgende to komponenter (figur 1A): en reporterkonstruksjon med DNA -elementet av interesse og en uttrykkskonstruksjon som omfatter TF av interesse og et gjærtranskripsjonaktiveringsdomene. Reporterkonstruksjonen med DNA -elementet "agn" kalles vanligvis "agn", mens uttrykkskonstruksjonen ofte blir referert til som "byttet". En typisk TF består generelt av et DNA-bindende domene, et transaktiverende domene og et signalfølende domene [7]. I et Y1H-system erstattes det DNA-bindende domenet til en gjær-TF (f.eks. GAL4) med et TF som mangler transkripsjonsaktiveringsfunksjonen. Derfor, hvis det er fysiske interaksjoner mellom TF og DNA, vil nedstrømsreporter bli aktivert uavhengig av om TF er en aktivator eller repressor [70].

Tegneserie illustrasjon av mekanismen som ligger til grunn for Y1H -analysen. (EN) Strukturene til en reporterkonstruksjon og en byttedyrkonstruksjon. (B) Gjærceller transformeres med både "agn" og "byttedyr" -konstruksjoner.

Tegneserie illustrasjon av mekanismen som ligger til grunn for Y1H -analysen. (EN) Strukturene til en reporterkonstruksjon og en byttedyrkonstruksjon. (B) Gjærceller transformeres med både "agn" og "byttedyr" -konstruksjoner.

Det er flere typer Y1H -reporterkonstruksjoner, som hver er designet for forskjellige eksperimenter. Gjærstammene som brukes for Y1H bærer vanligvis mutasjoner i flere auxotrofe gener. Derimot, trp1 (tryptofan), leu2 (leucine), hans3 (histidin) og ura3 (uracil) brukes vanligvis. De auxotrofiske mutantene med disse muterte genene er ikke i stand til å vokse i fravær av forskjellige essensielle stoffer, og reportergenet aktiveres via en interaksjon med en spesifikk TF som redder den auxotrofiske fenotypen [71]. Y1H -systemreportergenet er HIS3, som gjør gjærceller i stand til å vokse i fravær av eksogent levert histidin. I tillegg er Y1H-reporterkonstruksjonen ofte designet for å uttrykke genet som koder for beta-galaktosidase. Alle koloniene som er i stand til å vokse, blir deretter testet i en kolorimetrisk analyse.Spesielt resulterer produksjonen av beta-galaktosidase i spaltning av X-gal for å produsere blå kolonier.

Som angitt i figur 1, overføres reporterkonstruksjonen med det "agn" cis-virkende elementet og "byttet" -konstruksjonen med et TF-manglende aktiverende domene til gjærceller. Samspillet mellom det DNA-bindende domenet til 'byttet' og 'agnet' vil aktivere uttrykket av reportergenet. Mangel på interaksjon mellom "byttet" og "agnet" resulterer ikke i noe uttrykk.

Y1H -analysen kan bekrefte interaksjonene mellom proteiner og DNA av interesse uten å kreve renset protein. I tillegg beholder det TF-drevne proteinet sin naturlige struktur i gjærceller. Videre er Y1H -analyser relativt enkle å fullføre. Disse fordelene har gjort Y1H -analysen til en mye brukt teknikk for å påvise protein -DNA -interaksjoner. Fra den første applikasjonen til i dag har Y1H -analysen vært viktig for å verifisere bindingen av TF til DNA [72–76].

Dual-luciferase reporter analysesystem

Luciferasegenene har vært et av de mest generelt og mest brukte reportergenene siden de først ble brukt som reporter for genuttrykk i ris. Luciferase -reporteranalysen kan påvise bioluminescens generert av reaksjonen mellom luciferase og dens substrater. Dette systemet har blitt brukt til å verifisere interaksjoner mellom TFer og deres mål -DNA -sekvenser. Ekspresjonen av reportergenet måles for å kvantifisere aktiviteten til TF. Luciferase -reporteranalysen består av følgende to komponenter: en reporterkonstruksjon med målpromotoren og en effektorkonstruksjon med TFer. Disse komponentene er noe lik de i Y1H -systemet. Begge plasmidene overføres til planteceller, og hvis TF aktiverer målpromotoren, vil ekspresjonen av luciferase -genet gi luciferase. Intensiteten til fluorescensen produsert ved reaksjonen mellom luciferase og dets substrat kan brukes til å bestemme luciferaseaktivitetsnivået, noe som indikerer om TF er i stand til å samhandle med målpromotorfragmentet. Imidlertid kan forskjeller i transfeksjonseffektiviteten til hver prøve resultere i forskjellige fluorescensintensiteter mellom eksperimentgruppen og kontrollgruppen. Derfor kan det være vanskelig å bedømme om noen forskjeller mellom eksperimentelle og kontrollgrupper er forårsaket av aktiviteten til promotoren selv eller operasjonsfeil som påvirker variabler som transfeksjonseffektivitet.

Promega introduserte analysesystemet Dual-Luciferase® Reporter (DLR ™), og ga derved forskere en svært effektiv metode for å bruke to reportere for å forbedre den eksperimentelle nøyaktigheten. Doble journalister overfører to reporterkonstruksjoner til et enkelt system. Den ene reporterkonstruksjonen med et eksperimentelt reportergen (f.eks. PGL3 -familievektor) er koblet til en regulert promotor, mens den andre reporteren fungerer som en intern kontroll, som inneholder et distinkt reportergen (f.eks. PRL -familievektor), og er koblet til en konstitutiv promoter [77]. Uttrykket av pGL3 -vektorsekvensen er relatert til transkripsjonsaktiviteten til den regulerte promotoren. Transkripsjonell aktivitet av pRL -vektorsekvensen er upåvirket av de ytre forholdene og brukes til å normalisere og måle transkripsjonsaktiviteten til pGL3 -vektoren. Det er mulig å minimere effekten av flere iboende faktorer som kan påvirke nøyaktigheten av eksperimentet, inkludert forskjeller mellom celleplater, celletall, cellelevedyktighet, transfeksjonseffektivitet og lyseffektivitet [77]. Sammenlignet med luciferase-reporteranalysen, reduserer dual-luciferase-reporteranalysen sannsynligvis effekten av fremmede faktorer for å optimalisere den eksperimentelle nøyaktigheten.

Både pGreenII62-SK og pGreenII0800-LUC er ofte koblet til henholdsvis TF og sekvensen av interesse i ris-dual-luciferase-reporteranalyser [78, 79]. PGreenII0800-LUC-vektoren bærer ildflueluciferase (LUC) -genet under kontroll av promotoren av interesse, så vel som Renilla luciferase (REN) -gen under kontroll av CaMV 35S -promotoren [5]. For å generere konstruksjonen for en dual-luciferase reporteranalyse, settes en kodende sekvens inn i pGreenII62-SK-vektoren som en effektor og en promotorsekvens klones inn i pGreenII0800-LUC som en reporter. Risceller blir deretter infiltrert sammen med disse vektorene. Hvis TF er i stand til å binde seg spesifikt til promotoren, vil LUC reportergen vil bli uttrykt for å produsere det kodede ildflueluciferase -enzymet. De REN reportergen aktiveres samtidig under kontroll av CaMV 35S -promoter. Riscellene lyseres deretter i passiv lyseringsbuffer for å frigjøre ildfluen og Renilla luciferase -enzymer. Deretter tilsettes Luciferase Assay Reagent II til cellelysatene for å aktivere ildfluens luminescenssignal. Etter fullføring av ildflueluciferasereaksjonen, vil Renilla luciferase -enzym katalyserer produksjonen av et luminescenssignal, mens ildflueluminescenssignalet raskt slukkes etter tilsetning av Stop & amp Glo -reagensen til løsningen [77]. Dette er prosessen i en klassisk dual-luciferase reporteranalyse i ris (figur 2). I tillegg koinfiltreres de negative kontrollcellene med den pGreenII62-SK tomme vektoren og reporterkonstruksjonen.

Dual-luciferase reporteranalyse.

Dual-luciferase reporteranalyse.

Elektroforetisk mobilitetskiftanalyse

Den elektroforetiske mobilitetsskiftanalysen (EMSA) er en rask og enkel teknikk som vanligvis brukes til å oppdage og studere sekvensspesifikke DNA-bindende proteiner som TFer in vitro [80, 81]. Det er basert på prinsippet om at proteiner som binder seg til DNA-prober danner makromolekylære komplekser, som skifter saktere enn frie nukleinsyrer i ikke-denaturerende polyakrylamidgel. DNA-sonder kan merkes med kovalente eller ikke-kovalente fluoroforer, radioisotoper eller biotin [82–84]. Selv om forskjellige DNA -sekvenser kan brukes i et EMSA, fra korte oligonukleotider til sekvenser som omfatter flere tusen nukleotider/basepar, kan korte nukleinsyrer være å foretrekke når mål -DNA er veldefinert [80, 81, 85]. Sammenlignet med lange nukleinsyresekvenser er kortere sekvenser billigere og lettere å syntetisere. I tillegg bidrar den assosierte reduksjonen i antall ikke-spesifikke proteinbindingssteder til å forhindre interferens fra andre proteiner. Proteinene kan være avledet fra rå kjerneekstrakter eller hele celleekstrakter eller fra prokaryote ekspresjonssystemer. Imidlertid må konsentrasjonen av proteinet av interesse være større enn 1 ug/ul.

EMSA krever minst fire reaksjonsblandinger, som brukes for å bevise at et protein direkte og spesifikt kan binde seg til promotoren til et målgen. Disse blandingene er som følger (figur 3): en negativ kontroll med bare en biotin-merket probe en konvensjonell kontrollgruppe med en biotin-merket probe og proteinet en kald-konkurransekontroll med en biotin-merket probe, en kald-probe ( umerket) og proteinet og en mutant-sonde kald-konkurransekontroll med en biotin-merket probe, en mutant-probe (umerket) og proteinet. Både kald-sonde og mutant-sonde må brukes i betydelig høyere konsentrasjoner enn biotinsonden. Hvis båndet som tilsvarer biotinsonden ikke er i den laveste posisjonen, er det sannsynligvis noen urenheter i kontrollen. Hvis båndposisjonen i banen med blandingen av biotin-merket probe og protein er høyere enn biotin-probe-båndet, antyder dette at proteinet interagerer med DNA-sonden. Biotin-taggen kan binde seg til proteiner, og derved resultere i et falskt positivt mobilitetsskifte. Dermed brukes kaldt-konkurransekontrollen for å utelukke denne muligheten. Båndposisjonen til denne kontrollgruppen bør være på samme nivå som båndet til den negative kontrollgruppen hvis mobilitetsskiftet skyldes at proteinet spesifikt binder seg til sonden. Motsatt påvirker ikke kuldeprober samspillet mellom den biotinmerkede sonden og proteinet. Følgelig brukes denne kontrollen for å indikere at mobilitetsskiftet til det konvensjonelle kontrollgruppebåndet skyldes biotin. Mutant-sonden kan ikke påvirke samspillet mellom den biotin-merkede sonden og proteinet. Dermed brukes denne kontrollen for å indikere den spesifikke bindingen mellom proteinet og sonden. Alle resultatene indikerer samlet om TFer spesifikt kan binde seg til promotorer. I tillegg brukes den positive kontrollen i kommersielt tilgjengelige EMSA -sett for å sikre at analysen utføres korrekt under optimale eksperimentelle forhold.

Elektroforetisk mobilitetskiftanalyse.

Elektroforetisk mobilitetskiftanalyse.

Kromatinimmunutfelling

Kromatinimmunutfelling (ChIP) er en utmerket metode for å analysere samspillet mellom proteiner og DNA in vivo [86]. Denne teknikken innebærer immobilisering av protein-DNA-komplekser i levende celler med et kjemisk tverrbindingsmiddel (f.eks. Formaldehyd) og deretter tilfeldig bryte dem i små fragmenter av kromatin av en viss lengde med en fysisk-kjemisk-basert metode, inkludert sonikering (hydrodynamisk skjæring), enzymfordøyelse eller en mikrokokknukleasebehandling [87]. Når formaldehyd brukes som tverrbindingsmiddel, er ultralydbehandling vanligvis det foretrukne alternativet. Til slutt brukes spesifisiteten til antistoffer for antigener for å skaffe proteinet av interesse med et DNA -fragment [88]. En kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon (PCR) er den foretrukne metoden for å analysere ChIP DNA-fragmentet [87]. I tillegg til modenhet og lave kostnader ved neste generasjons sekvenseringsteknologi, har ChIP-seq gradvis blitt den vanligste teknikken for å studere disse protein-DNA-forholdene. Imidlertid kan ikke ChIP-seq gi presise sett med bindingssteder på grunn av uspesifikt genomisk DNA [89, 90]. Lambda-eksonuklease nedbryter bare naken dobbeltstrenget DNA i 5 ′ til 3 ′ orienteringen. Sammenlignet med ChIP-seq reduserer ChIP-exo bakgrunnsstøy av lambda-eksonuklease [90]. Mens fordøyelsestrinnet reduserer mengden gjenvunnet DNA fra ChIP, noe som påvirker den påfølgende sekvensering. For å bygge bibliotek er det nødvendig å fullføre to ineffektive ligeringstrinn for å legge til adaptere på DNA -sammenkoblede ender. Under PCR-prosessen produserer ofte små mengder start-DNA støydata på grunn av overforsterkning. En robust ChIP-exo-protokoll ved navn ChIP-eksperimenter med nukleotidoppløsning gjennom eksonuklease, unik strekkode og enkelt ligering (ChIP-nexus) overvinner problemet forårsaket av lave mengder DNA [91]. Den nye teknikken bruker et effektivt DNA-selvsirkulasjonstrinn for å legge til en adapter på DNA-ender. Derfor er ChIP-nexus uten mer start-DNA tilgjengelig for påfølgende sekvensering.

I ris har ChIP -eksperimenter blitt mye brukt for å undersøke de biologiske interaksjonene mellom proteiner av interesse og promotoren for målgener [78, 79, 92–95]. Et ChIP -eksperiment krever generelt utvikling av transgene risfrøplanter for påvisning av TFBS i stedet for en analyse av epigenetikk. En GFP -kodende sekvens er vanligvis smeltet i ramme til 3 'enden av TF -gensekvensen. Flag-taggen eller andre tagger kan imidlertid alternativt brukes til å merke TF-ene [92].

Når det gjelder ris, er tverrbinding av protein og DNA vanskelig i gammelt vev. Derfor blir ChIP-eksperimenter vanligvis fullført med 2–4 uker gamle transgene risplanter. Formaldehyd er et utmerket tverrbindingsmiddel som er i stand til å danne stabile protein-protein-, protein-DNA- og protein-RNA-komplekser i celler. Videre er de tverrbundne kompleksene generert av formaldehyd fullstendig reversible, noe som letter den påfølgende analysen av proteinet og DNA [96, 97]. Varigheten av tverrbindingstrinnet er en av de avgjørende faktorene som bestemmer om ChIP-eksperimentet vil bli fullført. Hvis dette trinnet er for kort, vil det være en utilstrekkelig mengde av målsegmentet, som til slutt fører til et falskt negativt resultat. Hvis dette trinnet får fortsette for lenge, vil det ikke bare forårsake overdreven bakgrunnsstøy, men også forstyrre ultralydbehandlingen [86]. Som en generell retningslinje bør tverrbindingen stoppes når materialet blir gjennomsiktig [98]. I tillegg må det tverrbundne materialet vaskes grundig med ddH2O for å fjerne eventuelt gjenværende formaldehyd, som kan påvirke de påfølgende eksperimentelle trinnene negativt. Videre kan flytende nitrogen brukes til å male tverrbundet risvev til et fint pulver, hvorfra rent kromatin vil bli ekstrahert [98]. Etter å ha resuspendert kromatinet i kjernelysebuffer, sonikeres løsningen for å skjære kromatinet til visse størrelser, noe som vil avhenge av studiemålet. Størrelsen på de resulterende fragmentene måles med 1% agarosegelelektroforese. Proteinet av interesse immunutfelles fra den fragmenterte kromatinoppløsningen med et antistoff som er spesifikt for merket smeltet til målproteinet [92, 95]. Vær oppmerksom på at kvaliteten på antistoffet er en kritisk faktor for gjenvinning av DNA -fragmenter. Diverse antistoffer har sine egne affiniteter for epitoper, noe som kan påvirke ChIP -resultatene [86, 87, 99]. DNA-et utvinnes fra bunnfallet av protein-DNA-fragmentkomplekset ved å reversere tverrbindingene, hvoretter DNAet renses før analyser. Prosessen involvert i et ChIP -eksperiment presenteres i figur 4.

Kromatin immunutfelling analyseprosess.

Kromatin immunutfelling analyseprosess.


Resultater

Effekter av pH, FBS og restreagenser på seklukskatalyserte bioluminescensreaksjoner

Som en nyutviklet utskilt luciferase antas det at secNluc eier fordelene med høy strukturell stabilitet, lang halveringstid og glødetype kinetikk fremfor andre utskilt luciferaser inkludert Gaussia, Metridia og Cypridina luciferases [13]. Vi lurer imidlertid på om forstyrrende faktorer som eksisterer i miljøet vil begrense anvendelsen siden den måtte kombineres med disse faktorene etter sekresjon. For å undersøke dette, forberedte vi først det rensede secNluc -proteinet. Etter transfeksjon av 293E-celler med det konstruerte pDC316-EBNA-secNluc-plasmidet, ble de utskilte proteiner i kulturmediet konsentrert og renset ved bruk av størrelsesekskluderingskromatografi. SDS-PAGE-analyse viste at proteinet som ble samlet fra størrelsesekskluderingskromatografitoppen tilsvarende omtrent 13 ml hadde en molekylvekt på 22 kD (figur 1A), som er lik den teoretiske størrelsen på secNluc. Luciferase -aktiviteten til det rensede proteinet ble påvist i påfølgende eksperimenter.

(A) Fremstilling av secNluc proteiner. SecNluc-proteiner ble utskilt av HEK 293E-celler transfektert med det konstruerte pDC316-EBNA-secNluc-plasmidet, renset via ultrafiltreringskonsentrasjon og størrelsesekskluderingskromatografi med Superdex 75-kolonnen (GE Healthcare), og analysert med 12% SDS-PAGE. Bane 1, proteinmarkørfelt 2, renset protein. (B) Virkninger av DMEM og RPMI1640 media pH på secNluc-katalyserte bioluminescensreaksjoner. Analysen ble utført som beskrevet i Materialer og metoder. (C) effekter av FBS på secNluc-katalysert bioluminescens reaksjoner. Analysen ble utført som beskrevet i Materialer og metoder. (D) effekter av flere kinesiske urtemonomerer, inkludert geniposid, ligustrazin, glycyrrhizic acid og puerarin på secNluc-katalyserte bioluminescensreaksjoner. Reagensene ble brukt i en konsentrasjon på 50 ug/ml, og analysene ble utført som beskrevet i Materialer og metoder. Ordinatverdiene representerer forholdet mellom RLU i gruppene kinesiske urtemonomerer og verdiene i kontrollgruppen. **, P & lt 0,01 og ***, P & lt 0,001. Feilfelt i (B) til (D) representerer standardfeil for gjennomsnittet fra 3 replikatmålinger.

Vi undersøkte deretter effekten av tre faktorer, pH, FBS og restreagenser, som er de vanlige forstyrrende faktorene som eksisterer i medium omkringliggende testceller, på secNluc-katalyserte bioluminescensreaksjoner. Resultatene viste at pH hadde en betydelig innflytelse på bioluminescensproduksjon (figur 1B). Lysintensitetene viste relativt liten variasjon fra pH -verdier fra pH 7,0 til 8,5, og den sterkeste lysytelsen ble observert ved pH 7,5. Når pH -verdien til mediet var under 7,0 eller over 8,5, reduserte imidlertid lysintensiteten raskt. Resultatet presentert i figur 1C viste at FBS kunne produsere noe luminescenssignal, selv i fravær av secNluc. Dette bakgrunnssignalet økte ettersom FBS-konsentrasjonen økte og kunne skjerme de målte bioluminescenssignalene produsert av secNluc-katalyserte reaksjoner når sistnevnte var svak. I tillegg ble de kinesiske urtemonomerer, geniposid, ligustrazin, glycyrrhizinsyre og puerarin, brukt til å etterligne restreagenser. Resultatet viste at selv om geniposid ikke hadde noen innflytelse på secNluc-katalyserte bioluminescensreaksjoner, så hadde ligustrazin, glycyrrhizinsyre og puerarin innflytelse (figur 1D). Nærmere bestemt kan 50 μg/ml glycyrrhizinsyre redusere bioluminescenssignalet til omtrent 40% av kontrollens. Disse resultatene indikerte at faktorer i mediet, for eksempel pH, FBS og restreagenser, kan ha betydelige effekter på secNluc-katalyserte bioluminescensreaksjoner og dermed sannsynligvis etterligne anvendelsene til secNluc-reportersystemet.

PBST ble brukt som en optimal buffer for secNluc-katalyserte bioluminescensreaksjoner

Vi prøvde deretter å finne en optimal buffer for secNluc-katalyserte bioluminescensreaksjoner. Denne optimale bufferen trengte for å gi en stabil pH og bidra til produksjon av stabil lysemisjonskinetikk av glødtype, som er viktige for presisjon og pålitelighet av reportersystemer. Her sammenlignet vi seks buffere: DMEM, RPMI1640, D10, R10, PBS og PBST. Bioluminescenssignalene fra DMEM-, RPMI1640-, D10- og R10 -gruppene forfallet raskt (figur 2). De relative lysenhetens (RLU) verdier på 60 -tallets tidspunkt falt til halvparten av deres opprinnelige verdier i DMEM- og RPMI1640 -gruppene og til 65% av deres opprinnelige verdier i D10- og R10 -gruppene, og signalene ble nesten helt bleknet etter 120 sekunder i DMEM- og RPMI1640 -gruppene og etter 150 s i D10- og R10 -gruppene. I PBS- og PBST -gruppene var imidlertid forfallshastighetene for bioluminescenssignalene åpenbart langsommere enn for de fire andre gruppene (figur 2). Av de to bufferne ga PBST den beste ytelsen, med mindre enn 10% reduksjon i RLU-verdien som ble observert ved 150 s, og denne bufferen oppfylte generelt kravene om å gi stabil pH og bidra til produksjon av stabil glødetype lysutslippskinetikk. Derfor valgte vi PBST som den optimale bufferen for secNluc-katalyserte bioluminescensreaksjoner.

Totalt ble 5 ng/ml secNluc og 3 μmol/l coelenterazine tilsatt til seks buffere: DMEM, RPMI1640, D10, R10, PBS og PBST.Den utsendte bioluminescensen på forskjellige tidspunkter (0 til 270 s med et intervall på 30 s) ble målt etter tilsetning av coelenterazine i en 96-brønns plate av en Biotek Synergy 2 multi-mode plateleser (Biotek, USA). Dataene som vises er middel ± standardfeil for tre uavhengige eksperimenter.

En enkel affinitetsrensingsstrategi for optimalisering av secNluc -reportersystemapplikasjoner

Siden forstyrrende faktorer i mediet kan påvirke secNluc-katalyserte bioluminescensreaksjoner, prøvde vi å utvikle en metode for å løse disse problemene. Magnetiske perler konjugert med et antistoff mot en bestemt proteinkode kunne gjenkjenne og fange secNluc som var smeltet sammen med merket og dermed skille enzymet fra det omkringliggende mediet gjennom et enkelt trinn bestående av magnetattraksjon og fjerning av supernatanten. Denne prosessen kan bli kvitt forstyrrende faktorer i mediet og overføre secNluc til en optimal buffer, og dermed forbedre anvendelsen av secNluc -rapportsystemet. Her smeltet vi en FLAG-tag til C-terminalen til secNluc ved hjelp av genetisk konstruksjon (figur 3A) og brukte anti-FLAG magnetiske perler for å utføre rensningsstrategien.

(A) Skjematisk fremstilling av det konstruerte pQCXIP-NF-κB-secNluc-FLAG-plasmidet. (B) Luminescens signaler indusert av anti-FLAG perler. 2,5 ul anti-FLAG-perler ble tilsatt til 100 ul PBST inneholdende 3 mikromol/l coelenterazin for å måle luminescenssignalene indusert av perlene. I tillegg ble 2,5 ul perler som binder secNluc-FLAG fusjonsproteiner brukt som den positive kontrollen, og PBST inneholdende coelenterazin alene ble brukt som den negative kontrollen. (C) og (D) utvinning av secNluc-FLAG proteiner i forskjellige medier etter rensing med anti-FLAG perler. 2,5 ul perler ble blandet med 100 ul av fire forskjellige medier som inneholdt det utskilte secNluc-FLAG-proteinet (C). Tilsvarende ble 2,5 ul og 10 ul perler blandet med 2 ml og 5 ml av de fire forskjellige mediene som inneholdt det utskilte secNluc-FLAG-proteinet (D). Perleisolasjon og bioluminescensmålinger ble utført som beskrevet i Materialer og metoder. (E) konsentrasjon av secNluc-FLAG protein ved hjelp av rensing strategi. 2 ml D10 og R10 kulturmedier ble blandet med 10 ul perler, og bioluminescensverdiene ble målt fra isolerte perler som ble resuspendert i 100 ul PBST (D10 med perler og R10 med perler) som beskrevet ovenfor. Bioluminescensverdiene fra 100 ul av de to dyrkede mediene (D10 og R10) ble målt samtidig. (F) og (G) Forbedring av rensingsstrategien for den lineære korrelasjonen mellom secNluc og avgitt bioluminescens. Dyrkningsmediet som inneholder det utskilte secNluc-FLAG-proteinet ble fortynnet fra 0- til 1024 ganger i D10- eller R10-medier, og 100 ul av de fortynnede løsningene og 100 ul av de resuspenderte løsningene som ble oppnådd fra de tilsvarende fortynnede løsningene ved hjelp av rensingen strategi ble brukt til å måle den utsendte bioluminescensen (F). 2 × 10 1 til 2 × 105 transfekterte celler per brønn ble inokulert i 24-brønns plater i 24 timer, og 100 ul av dyrkede medier og 100 ul av de resuspenderte løsningene hentet fra de tilsvarende dyrkede mediene ved hjelp av rensestrategien ble brukt for å måle den utsendte bioluminescensen (G). (H) eliminering av interferens fra glycyrrhizic acid ved hjelp av rensingsstrategien. Glycyrrhizic acid i konsentrasjoner fra 0 til 100 μg/ml ble tilsatt til D10 media inneholdende secNluc-FLAG proteinet. 100 ul media og 100 ul av de resuspenderte løsningene hentet fra de tilsvarende mediene ved hjelp av rensestrategien ble brukt til å måle den utsendte bioluminescensen. (I) Effekter av secNluc med eller uten FLAG-tag i forskjellige pH-verdier på secNluc-katalyserte bioluminescensreaksjoner. Analysen ble utført som beskrevet i Materialer og metoder. (J) Effekter av secNluc med eller uten FLAG-tag i forskjellige medikamentmonomerer på secNluc-katalyserte bioluminescensreaksjoner. På grunn av den omfattende fortynningsmultipelen ble logaritmisk beregning brukt for å redusere driftsgraden av data. I (B) til (J) er dataene vist gjennomsnitt ± standardfeil for tre uavhengige eksperimenter.

Vi undersøkte først om selve perlene kunne produsere luminescens. Resultatet presentert i figur 3 viste ingen forskjeller i luminescenssignaler fra prøver i både tilstedeværelse og fravær av perler, noe som indikerer at perlene ikke hadde noe bakgrunnssignal. Resultatet presentert i figur 3C bekreftet at for 100 ul media kunne 2,5 ul perler gjenopprette nesten alle secNluc-FLAG-proteinene. For 2 og 5 ml media kunne 10 ul perler gjenvinne henholdsvis omtrent 90% og 80% av secNluc-FLAG-proteiner, og 2,5 ul perler kunne gjenopprette henholdsvis ca. 65% og 50% av secNluc-FLAG-proteiner (fig. 3D). Dette resultatet indikerte at secNluc-FLAG proteiner kunne konsentreres dusinvis av ganger fra 2 og 5 ml løsning hvis de ble satt i 100 ul løsning. Som bevis var RLU-verdiene fra 2 ml DMEM og RPMI1640 ved bruk av 10 ul perler henholdsvis 18,4 ganger og 17,5 ganger høyere enn 100 μl av disse mediene i testen vår (figur 3E). Spesielt var gjenopprettingsegenskapene blant de fire mediene tydeligvis ikke forskjellige (figur 3C). Senere undersøkelse viste at tilsvarende med resultatet ovenfor (figur 1C), da mediet som inneholdt secNluc-FLAG ble fortynnet med en viss fold D10 eller R10, som representerte en viss lav konsentrasjon av secNluc-FLAG i medium, hadde RLU-verdiene en tendens til å være konstant på grunn av bakgrunns -FBS -signalet (figur 3F). Når du bruker rensemetoden, viste imidlertid RLU -verdiene en signifikant lineær korrelasjon med fortynningsfolden til verdien nærmet seg null (den nedre deteksjonsgrensen for apparatet) (figur 3F). En annen test avslørte et lignende resultat som sett i figur 3G. RLU -verdiene i gruppen med perlerensing hadde god lineær korrelasjon med de inokulerte celletallene gjennom hele testen. I gruppen uten perlerensing hadde imidlertid RLU -verdiene en tendens til å være konstant på grunn av FBS -bakgrunnssignalet når de inokulerte celletallene var mindre enn 2 × 103 celler per brønn i denne testen. I tillegg viste resultatet presentert i figur 3H at perlerensingsmetoden kunne bidra til å gjenopprette luciferaseaktiviteten til secNluc-FLAG som ble hemmet av glycyrrhizinsyre, et restreagens som etterligner (figur 1D).

Det var en mulighet for at den sammensmeltede FLAG-taggen i denne strategien kan ha stabiliserende effekt på den enzymatiske aktiviteten til secNluc. Vi testet dermed påvirkning av FLAG-tag ved å bruke secNluc og secNluc-FLAG i denne studien. Resultatene viste at RLU ikke hadde noen signifikant forskjell, selv om FLAG-tag eksisterte eller ikke ved hver pH-verdi (figur 3I), noe som viste at secNluc-katalyserte bioluminescensreaksjoner ikke ble påvirket av FLAG-tag under forskjellig pH-verdi. Videre viste secNluc-FLAG ingen stabiliserende effekt på secNluc-katalyserte bioluminescensreaksjoner i nærvær av medikamentmonomerer (figur 3J).

Rensingsstrategien optimaliserer TNF-α-stimulert NF-κB aktiveringsanalyse-En casestudie

Vi brukte TNF-α-stimulert NF-κB aktiveringsanalyse som en casestudie for å undersøke de forbedrede effektene som følge av vår rensingsstrategi. RLU-verdiene i Medium-gruppen ble holdt på omtrent 600 enheter når et lite antall inokulerte celler ble brukt (mindre enn 4000 celler per brønn uten TNF-α-stimulering og mindre enn 500 celler per brønn med TNF-α-stimulering) (figur 4A og 4B), noe som førte til en lav økning i signaler som reagerer på TNF-α-stimulering når inokulerte celler var mindre enn 4000 per brønn i denne testen (figur 4C). I Beads Purification-gruppen var imidlertid økningen i signaler som reagerer på TNF-α-stimulering ganske høy, selv når de inokulerte cellene var færrest 125 per brønn i denne testen (figur 4C). Økningsfolden hadde en tendens til å være konstant når inokulerte celler var mer enn 250 per brønn i denne testen (figur 4C). Selv om fortynning av mediet med PBST (50% medium-gruppe og 10% medium-gruppe) kan senke bakgrunnssignalet (fig. 4A og 4B), var økningen i signaler som reagerer på TNF-α-stimulering dessuten ikke forbedret sammenlignet med mediet gruppe når inokulerte celler var mindre enn 8000 per brønn i denne testen (figur 4C).

(A) og (B) Måling av bioluminescens fra celler uten eller med TNF-αstimulering. Monoklonale HeLa-celler som var stabilt transfektert med NF-KB-secNluc-FLAG-genet ble inokulert ved forskjellige tettheter (0 til 8000 celler per brønn) i 24-brønns plater i 12 timer. For TNF-a-stimulering ble 50 ng/ml TNF-a tilsatt i 12 timer for å indusere aktivering av NF-KB signalveien (B). 100 ul av hvert dyrket medium ble utsatt for magnetisk perlerensing, og perlene ble resuspendert i 100 ul PBST. 100 μl resuspendert løsning (perlerensing), 100 μl dyrket medium (medium), 50 og 10 μl kulturmedier som ble supplert med PBST til 100 μl (50% medium og 10% medium) ble brukt til å måle den utsendte bioluminescensen . Eksperimentene ble gjentatt tre ganger med sammenlignbare resultater. (C) Forholdet mellom RLU i grupper med TNF-α-stimulering til de i grupper uten TNF-α-stimulering. Dataene som vises er middel ± standardfeil i tre uavhengige eksperimenter.


Hva er ASV -analyse?

Mens OTU -klyngetilnærminger prøver å uskarpe lignende sekvenser i en abstrakt konsensus -sekvens, og dermed minimere påvirkningen av eventuelle sekvenseringsfeil i mengden lesninger, prøver Amplicon Sequence Variant (ASV) -tilnærmingen å gå motsatt retning. ASV -tilnærmingen starter med å bestemme hvilke eksakte sekvenser som ble lest og hvor mange ganger hver eksakte sekvens ble lest. Disse dataene vil bli kombinert med en feilmodell for sekvenseringskjøringen, slik at sammenligning av lignende avlesninger kan fastslå sannsynligheten for at en gitt avlesning ved en gitt frekvens ikke skyldes sekvensfeil. Dette skaper i hovedsak en p-verdi for hver eksakte sekvens, der nullhypotesen tilsvarer at den eksakte sekvensen er en konsekvens av sekvenseringsfeil.

Etter denne beregningen filtreres sekvenser i henhold til en viss terskelverdi for konfidens, og etterlater en samling eksakte sekvenser med en definert statistisk konfidens. Fordi dette er eksakte sekvenser, generert uten klynging eller referansedatabaser, kan ASV -resultater lett sammenlignes mellom studier som bruker samme målområde. I tillegg bør en gitt målgen -sekvens alltid generere den samme ASV og en gitt ASV, som er en eksakt sekvens, kan sammenlignes med en referansedatabase med en mye høyere oppløsning som muliggjør mer presis identifisering ned til artsnivået og til og med potensielt utover.

'ASV -tilnærmingen identifiserer enkle, eksakte sekvenser som statistisk støttes som tilstede i prøven.

Metastase

Metastase er en samling av mange trinn, en prosess formidlet av en rekke gener som er involvert i celleadhesjon, motilitet, nedbrytning av den ekstracellulære matrisen og angiogenese. Mange av de genetiske manipulasjonene som har forbedret vår forståelse av noen av disse trinnene ble gjort i Rip1Tag2 -transgene modellen for kreft i bukspyttkjertelen (9, 10). Det er noen få metastatiske modeller i GEM -er, men den teoretiske fordelen med GEM -er ved å studere metastaser fremfor ortotopiske injeksjonsmodeller er at man kan modellere alle trinnene med metastase i førstnevnte og bare de siste trinnene med metastase i sistnevnte. I tillegg tillater GEM å studere samspillet mellom immunrespons og metastase. Flere perler av metastaser er nødvendig for å belyse denne komplekse prosessen ytterligere, ettersom metastase er dødsårsaken hos de fleste kreftpasienter.


Bruke Beta-Glo®-analysesystemet for å bestemme beta-galaktosidaseaktivitet i gjær

Beta-Glo® Assay System Cat.# E4720, E4740, E4780 ble utviklet for rask, sensitiv og konsistent kvantifisering av β-galaktosidase i pattedyrceller ved bruk av et enkelt reagens-tillegg. Eksperimentene beskrevet i denne artikkelen viser imidlertid at det også kan brukes til å analysere β-galaktosidaseuttrykk i gjær to-hybrid og tre-hybrid systemer. Beta-Glo®-reagenset brukes til raskt å lysere gjærceller og kvantifisere β-galaktosidase-enzymaktiviteten for å påvise protein: protein eller RNA: proteininteraksjoner. På grunn av den raske lyseringen og kvantifiseringen og dens flerbrønnformat, kan Beta-Glo®-analysesystemet også tilpasses screening med høy gjennomstrømning, noe som muliggjør raskere screening for potensielle bindingspartnere.

Introduksjon

De lacZ -genet brukes ofte som reporter for å overvåke genuttrykk. Analyser for lacZ-genprodukt, og beta-galaktosidase, kan utføres på en rekke måter, inkludert kolorimetriske analyser på filterdyrkede gjærkolonier og enzymatiske analyser av ryddede gjærlysater. Her beskriver vi bruk av en enzymatisk analyse, Beta-Glo & reg Assay System, der tilsetning av et enkelt reagens direkte til gjær tillater rask kvantifisering av & beta-galaktosidase. Spesielt bruker vi Beta-Glo & reg Assay System med gjær to- og trehybridsystemene.

Gjæren, Saccharomyces cerevisiae, har blitt et viktig verktøy for genetikk, molekylærbiologi og biokjemi. Gjær to- og trehybridsystemene er nyttige analyser for å identifisere og analysere protein: protein og RNA: proteininteraksjoner ((1)). I gjær-to-hybridsystemet, når fusjonsproteinet, Protein X-LexA DNA-bindende domene, binder fusjonsproteinet, Protein Y-transkripsjonsaktiveringsdomenet, lacZ, er transkribert (figur 1, panel A). Dette tillater analyse av direkte protein: protein -interaksjoner. I gjær-tre-hybridsystemet testes et RNA-bindende protein (RBP) knyttet til et transkripsjonsaktiveringsdomene (AD) i kombinasjon med en RNA-sekvens (figur 1, panel B). Et RNA: proteininteraksjon resulterer i aktivering av HIS3 og lacZ -reportergener ((1) (0)). Systemet har blitt brukt til å teste kandidat-RNA-protein-interaksjoner, for å isolere interaksjon-defekte mutanter og for å identifisere proteiner som binder en gitt RNA-sekvens. Omvendt gjær tre-hybrid skjermer har også blitt brukt til å identifisere bindingssteder for RNA-bindende proteiner ((0) (4) (5)).

Figur 1. Generell skjematisk for gjær to- og tre-hybridsystemer.

Panel A. I gjær-to-hybridsystemet, når fusjonsproteinet, Protein X-LexA DNA-bindende domene, binder fusjonsproteinet, protein Y-transkripsjonsaktiveringsdomenet, lacZ, er transkribert. Disse interaksjonene tillater analyse av direkte protein: protein -interaksjoner. Panel B. I gjær-tre-hybridsystemet testes et RNA-bindende protein (RBP) knyttet til et transkripsjonsaktiveringsdomene (AD) i kombinasjon med en RNA-sekvens. Et RNA: proteininteraksjon resulterer i aktivering av HIS3 og lacZ -reportergener (1,2). Systemet har blitt brukt til å teste kandidat-RNA-protein-interaksjoner, for å isolere interaksjon-defekte mutanter og for å identifisere proteiner som binder en gitt RNA-sekvens. Omvendt gjær tre-hybrid skjermer har også blitt brukt til å identifisere bindingssteder for RNA-bindende proteiner (2–4).

& Ldquostrength & rdquo for interaksjonene i to- og trehybridsystemene bestemmes ved å analysere enten & -galaktosidaseaktivitet eller ved å bestemme resistensnivået mot 3-aminotriazol, som overvåker HIS3 journalistaktivitet. & beta-galaktosidase kan analyseres ved å måle omdannelsen av en laktose-analog til et kromogent eller luminescerende produkt. Denne analysen kan utføres ved hjelp av enten kolonier som er permeabiliserte på et filter eller i et cellelysat. Filteranalysen gir raske, men kvalitative resultater, væskeanalysen er mer kvantitativ, men også mer tidkrevende.

Beta-Glo & reg analysesystem tillater rask, sensitiv og konsekvent kvantifisering av & beta-galaktosidase. Mens analysen opprinnelig ble utviklet og optimalisert for pattedyrceller, har vi tilpasset den for bruk i gjær. På grunn av den raske lyse og kvantifisering har Beta-Glo & reg analysesystem et stort potensial for screening av protein: protein og RNA-protein med høy gjennomstrømning.

Optimalisering av Beta-Glo & reg analysesystem for bruk i gjær tre-hybrid system

Beta-Glo & reg analysesystemet ble optimalisert i gjær ved bruk av trehybridsystemet. En RBP (i dette eksemplet fem-3 bindingsfaktor (FBF) fra C. elegans) ble fusjonert til et transkripsjonsaktiveringsdomene, og forskjellige RNA ble fusjonert til MS2 stamsløyfesekvensen. Først bestemte vi at Beta-Glo & reg-reagens lyserte gjær, slik det var nødvendig for analysen. Femti mikroliter gjærkultur på A600 0,1 ble tilsatt til 50 og mikroliter Beta-Glo & reg-reagens, inkubert i 30 minutter og belagt på ikke-selektive medier. Ingen kolonier vokste etter 3 dager ved 30 & degC mange vokste på kontrollplaten [celler ikke behandlet med reagenset (ikke vist)].

Deretter ble den optimale inkubasjonstiden bestemt. En reaksjon med 50 & mikrol gjær ved A600 0,1 ble inkubert med 50 & mikrol Beta-Glo & reg-reagens. Etter forskjellige inkubasjonstider ble luminescens målt (figur 2, panel A). RNA -sekvensene som ble brukt i analysen, binder RBP med varierende affiniteter. Med alle fire RNA-er, ble beta-galaktosidaseaktiviteten plateauert etter 60 minutter. For et sterkt samspillende RNA, RNA1 (Kd 25nM), reduserte signalet etter 120 minutter. I alle påfølgende eksperimenter ble reaksjonene inkubert i 60 minutter.

Figur 2. Optimalisering av Beta-Glo-analysesystemet i Saccharomyces cerevisiae.

Panel A. Fire RNA-fusjoner og RBP-AD ble transformert til gjær. Beta-Glo®-reagens ble tilsatt gjær dyrket til A600 0,1 og inkuberes i 30, 60, 90 og 120 minutter. β-galaktosidaseaktivitet ble målt som luminescens og plottet som relative lysenheter (RLU) versus inkubasjonstid. Panel B. Ti RNA-fusjoner og RBP-AD ble transformert til gjær. Beta-Glo®-reagens ble tilsatt gjær dyrket til A600 på 0,1 eller til stående fasegjær (A600 & gt1.0) fortynnet til et A600 0,1 og inkuberes i 60 minutter. β-galaktosidaseaktivitet ble målt ved bruk av et luminometer og representert som luminescens (RLU). Grafen sammenlignet hvert RNA som ble testet i begge vekstfasene. RNA tilsvarer ikke de i panel A. Panel C. En villtype RNA-fusjon, mutant RNA-fusjon og tom vektor ble transformert til gjær med RBP-AD. Gjæren ble vokst til A600 på 1,0 og fortynnet i serie til 0,0001. Beta-Glo®-reagens ble inkubert med gjær i 60 minutter, med A600 område på 1,0, 0,1, 0,001, 0,001 og 0,0001. β-galaktosidaseaktivitet ble målt som luminescens og presentert som RLU versus absorbans ved 600 nm.

For å teste effekten av vekstfase på reporterdeteksjon, ble gjær vokst til lav tetthet (A.600 på 0,1 og ndash1.0) og til høy tetthet (A600), og & beta-galaktosidaseaktivitet ble bestemt ved bruk av Beta-Glo & reg analysesystem. Ti forskjellige RNAer, som representerer forskjellige affinitetsmål for RBP, ble testet i de to vekstfasene (figur 2, panel B). Gjær ble vokst til A600 på 0,1 og til A600 av

2.0. Gjær ved høy tetthet ble fortynnet til A600 på 0,1.Etter en 60 minutters inkubasjon med Beta-Glo & reg-reagens ble luminescens målt. I alle RNA -testene var luminescensen detektert større med gjær ved lav tetthet.

For å bestemme det optimale antall gjær per analyse, A600 versus signal-støy-forhold ble testet ved bruk av tre RNA-konstruksjoner: villtype-RNA, et mutant RNA og tom vektor. Gjær ble vokst til A600 på 1,0 og fortynnet i serie til 0,1, 0,01, 0,001 og 0,0001. 50 mikroliter fortynnet gjær ble inkubert med 50 & mikrol Beta-Glo & reg-reagens i 60 minutter. Luminescenssignalet viste at analysen var lineær over et 10.000 ganger område, men A600 på 1,0 hadde et større signal-til-støy-forhold enn 0,1 (figur 2, panel C).

Optimalisert protokoll

Gjærkulturer ble dyrket i selektive frafallsmidler til lav tetthet (A.600 av 0,1 og ndash1,0). Kulturer ble fortynnet til A600 på 0,1. Et like stort volum Beta-Glo & reg-reagens ble deretter tilsatt, og blandingene ble inkubert ved romtemperatur i 60 minutter. Reaksjonene ble blandet og 10 & mikrol alikvotert i tre Eppendorf -rør. Prøvene ble deretter lest i et luminometer (BD Monolight & trade 2010 eller Turner Biosystems 20/20) i ett sekund.

Påvisning og beta-galaktosidaseaktivitet i gjær tre- og tohybride systemer med Beta-Glo & reg analysesystem

For å teste om Beta-Glo & reg-analysesystemet som ble brukt for gjær-trehybridsystemet nøyaktig reflekterte binding observert i andre analyser, ble RBP-AD-vektoren transformert til gjær med tom vektor, villtype-RNA og mutant RNA (figur 3, panel A) . Denne RBP binder seg spesifikt til villtypesekvensen som bestemt ved en & beta-galaktosidasekolonifilterflekkanalyse, HIS3 vekstanalyse og elektroforetisk mobilitetskiftanalyse (EMSA (0) (4) (5) (7)). I Beta-Glo & reg-analysesystemet bundet RBP spesifikt til sitt RNA-mål, men ikke den tomme vektoren eller mutant-RNA. Dermed ga Beta-Glo & reg analysesystemet konsekvente resultater som korresponderte godt med andre analyser. Andre kombinasjoner av RBP og RNA -mål ga lignende resultater (ikke vist).

Figur 3. Beta-galaktosidaseaktivitet bestemt ved bruk av Beta-Glo-analysesystemet med gjær-tre- og to-hybridsystemene.

Panel A. Wildtype RNA-fusjon, mutant RNA-fusjon og tom RNA-kontrollvektor ble transformert til gjær med RBP-AD. Beta-Glo®-reagens ble inkubert med gjær dyrket til A600 0,1 i 60 minutter. β-galaktosidaseaktivitet ble målt med et luminometer og representert som luminescens (RLU). Panel B. Tom LexA DNA-bindende domenevektor og to samspillende fusjonsproteiner ble transformert til gjær med RBP-AD. Beta-Glo®-reagens ble inkubert med gjær dyrket til A600 0,1 i 60 minutter. Som i panel A ble ß-galaktosidaseaktivitet målt ved bruk av et luminometer og representert som RLU.

Beta-Glo & reg analysesystem kan også brukes til å måle og beta-galaktosidaseaktivitet fra gjær-to-hybridsystemet. Ved å bruke to-hybridsystemet til RBP-AD og LexA DNA-bindende domenevektorer (tomme vektorer og positive kontrollproteiner: Protein 1 og Protein 2) ble Beta-Glo & reg analysesystem brukt til å overvåke protein: proteininteraksjon i gjær ( Figur 3, panel B). RBP så ut til å samhandle med begge proteiner som forventet fra andre uavhengige data, det ga ikke signifikant signal med den tomme vektoren.

Konklusjon

Beta-Glo & reg analysesystem kan brukes til å analysere og beta-galaktosidaseaktivitet fra gjær. Ved bruk av gjærs tre- og tohybridsystem ble & beta-galaktosidaseaktivitet målt raskt med høy spesifisitet og reproduserbarhet. Optimale betingelser for Beta-Glo & reg-analysesystemet ble bestemt ved bruk av en RBP- og RNA-sekvens i gjær-tre-hybridsystemet. Beta-Glo & reg-analysesystemet har allerede blitt brukt til å detektere interaksjoner i gjær-tre-hybrid-systemet: RBP-RNA-dirigerte tester ((0) (4) (5) (9) (10)) og RBP-RNA-målskjermbilder ((0) (4) (5) (9)). Denne analysen har flere fordeler i forhold til andre og beta-galaktosidase-analyser: den er enkel, rask og sensitiv med et stort dynamisk område (over fire størrelsesordener (12)).


Overvåkning av stamceller med en direkte eller indirekte merkingsmetode

Molekylære bildeteknikkene tillater overvåking av de transplanterte cellene i de samme individene over tid, fra tidlig lokalisering til overlevelse, migrasjon og differensiering. Vanligvis er det to metoder for stamcellemerking: direkte og indirekte merkingsmetoder. Den direkte merkingsmetoden introduserer et merkemiddel i cellen, som er stabilt inkorporert eller festet til cellene før transplantasjon. Direkte merking av celler med radionuklider er en enkel metode med relativt færre bivirkninger knyttet til genetiske responser. Imidlertid kan den bare tillate kortsiktig distribusjon av transplanterte celler på grunn av det avtagende bildesignalet med radiodecay, i henhold til de fysiske halveringstidene, eller signalet blir mer diffust med celledeling og spredning. Den indirekte merkingsmetoden er basert på ekspresjon av et reportergen som er transdusert inn i cellen før transplantasjon, som deretter visualiseres ved injeksjon av en passende sonde eller substrat. I denne gjennomgangen dekkes ulike avbildningsstrategier for å overvåke overlevelse og atferdsendring av transplanterte stamceller. Ved å ta disse nye tilnærmingene sammen, kan de direkte og indirekte merkemetodene gi ny innsikt i rollene som in vivo stamcelleovervåking, fra benk til seng.

Dette er en forhåndsvisning av abonnementsinnhold, tilgang via institusjonen din.


Se videoen: P3S08UTM C- IPGKDA A- UM B - UPNM BDEWAN INI KESAL TERHADAP NGO KEPENGGUNAAN DI MALAYSIA YANG MEN (August 2022).